CYP2C9和VKORC1基因多态性对华法林剂量的影响研究

梁红梅 邬银伟 王艳群

【摘要】 目的 探究細胞色素氧化酶2C9（CYP2C9）基因和维生素K环氧化物还原酶复合物1基因（VKORC1）-1639 G/A多态性对华法林初始抗凝剂量的影响。方法 200例使用华法林患者， 观察患者使用华法林5～7 d后凝血酶原时间（PT）和国际标准化比值（INR）， 记录患者服用华法林初次达标天数、总用量和平均每日用量， 同时测定患者CYP2C9位点基因型（*1、*2、*3）和VKORC1-1639位点基因型（AA、AG、GG）。结果 CYP2C9*1、CYP2C9*2/*3 VKORC1-1639 AG/GG基因型患者初次达标天数分别为（14.47±1.52）、（9.77±0.91）d， 总用量分别为（115.13±11.47）、（56.31±5.49）mg， 平均每日用量分别为（5.22±0.53）、（4.36±0.44）mg， CYP2C9*1、CYP2C9*2/*3 VKORC1-1639 AA基因型患者初次达标天数分别为（9.24±0.94）、（5.37±0.52）d， 总用量分别为（52.37±5.14）、（15.56±1.42）mg， 平均每日用量分别为（3.02±0.35）、（3.21±0.36）mg;CYP2C9*1、CYP2C9*2/*3 VKORC1-1639 AG/GG基因型患者初次达标天数均长于CYP2C9*1、CYP2C9*2/*3 VKORC1-1639 AA基因型患者， 总用量及平均每日用量均大于CYP2C9*1、CYP2C9*2/*3 VKORC1-1639 AA基因型患者， 差异有统计学意义（P<0.05）。结论 对于服用华法林的患者， 对CYP2C9、VKORC1-1639基因多态性的测定具有重要指导价值， 能帮助临床实施个体化用药， 值得临床应用与推广。

【关键词】 华法林;细胞色素氧化酶2C9基因;维生素K环氧化物还原酶复合物1基因;基因多态性

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2019.19.110

【Abstract】 Objective   To investigate the effect of cytochrome oxidase 2C9 （CYP2C9） gene and vitamin K epoxide reductase complex 1 （VKORC1） - 1639 G/A polymorphism on the initial anticoagulant dose of warfarin. Methods   There were 200 patients treated with warfarin. Their prothrombin time （PT） and international normalized ratio （INR） were observed after 5～7 d of warfarin， and first standard-reaching day of warfarin administration， total dosage and daily dosage of warfarin were recorded. The genotypes of CYP2C9 （* 1， * 2， * 3） and VKORC1-1639 （AA， AG， GG） were also determined at the same time. Results   Patients with CYP2C9*1 and CYP2C9*2/*3 VKORC1-1639 AG/GG genotypes had first standard-reaching day respectively as （14.47±1.52）， （9.77±0.91）d， total dosage respectively as （115.13±11.47）， （56.31±5.49）mg， and mean daily dosage respectively as （5.22±0.53）， （4.36±0.44）mg. Patients with CYP2C9*1 and CYP2C9*2/*3 VKORC1-1639 AA genotypes had first standard-reaching day respectively as （9.24±0.94）、（5.37±0.52）d，  total dosage respectively as （52.37±5.14）， （15.56±1.42）mg， and mean daily dosage respectively as （3.02±0.35）， （3.21±0.36）mg. Patients with CYP2C9*2/*3 VKORC1-1639 AG/GG genotypes had longer first standard-reaching day than patients with CYP2C9*1 and CYP2C9*2/*3 VKORC1-1639 AA genotypes， and more total dosage and mean daily dosage than patients with CYP2C9*1 and CYP2C9*2/*3 VKORC1-1639 AA genotypes. Their difference was statistically significant （P<0.05）. . Conclusion   For the patients taking warfarin， it has important guiding value for the determination of CYP2C9 and VKORC1-1639 gene polymorphism， and can help to implement individualized drug use in clinic. It is worthy of clinical application and promotion.

【Key words】 Warfarin; Cytochrome oxidase 2C9 gene; Vitamin K epoxide reductase complex 1 gene; Gene polymorphisms

华法林作为一种香豆素衍生物， 在血栓性疾病的抗凝治疗中发挥着重要作用， 是目前临床上应用最广泛的口服抗凝药物。其主要用于肺栓塞、深静脉血栓等栓塞性疾病治疗以及人工心脏瓣膜置换术后、心房颤动等疾病的血栓栓塞的预防[1]。但华法林治疗窗窄， 达到相同的抗凝效果时， 不同个体所需华法林剂量相差可达20倍以上， 用药时发生出血或栓塞的风险较高， 其不良反应是困扰临床医生和患者的普遍问题[2， 3]。研究表明[4]， 患者华法林用药剂量受遗传和非遗传等多个因素的影响， 其中遗传因素是造成其剂量个体差异的主要原因之一， 在亚洲人群的遗传因素的影响中， CYP2C9和VKORC1-1639位点基因型是影响华法林需求剂量个体差异的主要因素， 这两个位点在国内的检测更具备临床意义。本研究测定患者CYP2C9、VKORC1-1639位点基因型， 并观察其多态性对华法林初始抗凝剂量的影响， 现报告如下。

1 资料与方法

1. 1 一般资料 选取本院2017年2月～2018年2月收治的华法林使用患者200例， 纳入标准：①资料完善者;②依从性较好者;③患者疾病为心房颤动、肺栓塞及下肢深静脉血栓。排除标准：①严重肝肾功能异常者;②不愿加入本次研究且不予合作者;③中途退出者;④既往有颅内出血、恶性肿瘤者。其中男127例， 女73例;年龄28～79岁， 平均年龄（51.27±5.14）岁;平均身高（170.17±6.54）cm;平均体重（67.27±6.51）kg。本研究已经过本院伦理委员会批准进行。

1. 2 方法

1. 2. 1 药品与设备 华法林钠片（齐鲁制药有限公司， 国药准字H37021314）， DNA提取试剂盒由Promega（北京）生物技术有限公司提供， 聚合酶链式反应（PCR）试剂由大连宝生物技术有限公司提供， DNA测序仪为QIAGEN PymMark Q24焦磷酸测序仪， PCR反应在EPFmdmf5331型热循环仪上进行。

1. 2. 2 血样采集与DNA提取 采集研究对象5 ml外周血， 采用全血基因组提取试剂盒的抽提， 操作按试剂盒说明书进行。提取DNA需要用紫外分光光度计测定浓度， 样品无蛋白或RNA污染， OD260/OD280=1.8～2.0， OD260/OD230≥2.0;DNA含量要求：提取的标本必须≥50 ng/μl;提取完的DNA应立即进行检测， 否则请于（-20±5）℃保存。PCR反应体系（20 μl）：无菌去离子H2O 15.6 μl， 10×buffer 2.0 μl， 4×dNTPs（10 mmol/L）0.4 μl， 非限制引物2F（10 μmol/L）0.5 μl， 限制引物2R（10 μmol/L）0.1 μl， Taq酶1 U;DNA模板：0.5 μl;分子信标2beaconC（T）（10 μmol/L）：0.5 μl。PCR反应采用两步法45个循环扩增， 预变性95℃ 3 min， CYP2C9*2和CYP2C9*3：95℃ 5 s， 62℃ 15 s;CYP4F2 V433M、VKORC1 1173C/T和EPHX1：95℃ 5 s， 60℃ 15 s， 最后进行72℃ 2 min延伸。

1. 3 观察指标 比较研究对象服用华法林初次达标天数、总用量用量和平均每日用量。

1. 4 统计学方法 采用SPSS19.0统计学软件处理数据。计量资料以均数±标准差（ x-±s）表示， 采用t检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

CYP2C9*1、CYP2C9*2/*3 VKORC1-1639 AG/GG基因型患者初次达标天数分别为（14.47±1.52）、（9.77±0.91）d， 总用量分别为（115.13±11.47）、（56.31±5.49）mg， 平均每日用量分别为（5.22±0.53）、（4.36±0.44）mg， CYP2C9*1、CYP2C9*2/*3 VKORC1-1639 AA基因型患者初次达标天数分别为（9.24±0.94）、（5.37±0.52）d， 总用量分别为（52.37±5.14）、（15.56±1.42）mg， 平均每日用量分别为（3.02±0.35）、（3.21±0.36）mg;CYP2C9*1、CYP2C9*2/*3 VKORC1-1639 AG/GG基因型患者初次达标天数均长于CYP2C9*1、CYP2C9*2/*3 VKORC1-1639 AA基因型患者， 总用量及平均每日用量均大于CYP2C9*1、CYP2C9*2/*3 VKORC1-1639 AA基因型患者， 差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。

3 讨论

华法林为临床最常用的防治血栓栓塞的香豆素类口服抗凝药， 于20世纪40年代由美国威斯康星大学合成， 因其价格低廉、服用方便、药效作用持续时间长， 且兼有抗凝和溶栓的双重作用， 长期作为心臟人工瓣膜置换术后、非瓣膜性心房纤颤或心房扑动、肺栓塞以及深静脉血栓抗凝治疗等一线预防与治疗药物[5， 6]。

临床上常以PT及INR作为华法林抗凝效果的监测指标。传统给药方案需医生根据多次监测INR值的情况增减华法林剂量直至INR达标， 这种方式导致抗凝疗法调整周期长， 期间出血及梗死风险高[7， 8]。近年来的研究显示[9]， 华法林维持剂量个体差异与基因变异相关。本研究结果显示， CYP2C9*1、CYP2C9*2/*3 VKORC1-1639 AG/GG基因型患者初次达标天数分别为（14.47±1.52）、（9.77±0.91）d， 总用量分别为（115.13±11.47）、（56.31±5.49）mg， 平均每日用量分别为（5.22±0.53）、（4.36±0.44）mg， CYP2C9*1、CYP2C9*2/*3 VKORC1-1639 AA基因型患者初次达标天数分别为（9.24±0.94）、（5.37±0.52）d， 总用量分别为（52.37±5.14）、（15.56±1.42）mg， 平均每日用量分别为（3.02±0.35）、（3.21±0.36）mg;CYP2C9*1、CYP2C9*2/*3 VKORC1-1639 AG/GG基因型患者初次达标天数均长于CYP2C9*1、CYP2C9*2/*3 VKORC1-1639 AA基因型患者， 总用量及平均每日用量均大于CYP2C9*1、CYP2C9*2/*3 VKORC1-1639 AA基因型患者， 差异有统计学意义（P<0.05）。

华法林为混旋体， 全部由肝脏代谢， S-华法林的抗凝活性是R-华法林的3～5倍[10]。华法林的个体化用药一直是人们关注的焦点。CYP2C9、VKORC1-1639直接影响患者对华法林的敏感性， 导致患者对华法林疗效、出血风险产生差异[11]。CYP2C9 *2或*3基因突变可以使得华法林的代谢降低， 其在患者体内蓄积后抗凝作用显著增强， 可能导致出血等严重不良反应。VKORC1是华法林抗凝作用的靶点， 是维生素K依赖性凝血因子生成过程中的限速酶， 其阻碍维生素K由环氧化物形式转化成氢醌形式， 从而阻断凝血因子的活化， 產生抗凝作用。VKORC1基因突变患者对华法林敏感性增加， 可能导致华法林抗凝作用增强， 并出现出血等严重不良反应。

综上所述， CYP2C9、VKORC1-1639基因多态性是影响华法林剂量个体和种族差异的重要影响因素， 因此临床对于需要服用华法林的患者应将INR与CYP2C9、VKORC1基因多态性的检测相结合， 估测华法林的维持剂量、确保用药安全。

参考文献

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[收稿日期：2019-02-21]