泪腺良性淋巴上皮病变的病理特点及IgG4和C3的表达△

陈叶青 董志军 崔秀成 杨新吉

良性淋巴上皮病变(benign lymphoepithelial lesion，BLEL)，亦称Mikulicz病，是一种以组织中大量淋巴细胞、上皮细胞来源的良性病变[1]。泪腺BLEL的临床表现主要以双侧或单侧泪腺弥漫性无痛性肿大、眼睑肿胀为特征，反复发作可导致泪腺纤维化，破坏泪腺的正常功能，严重影响患者的生活质量[2]。泪腺BLEL确切的发病机制和始动因素尚不明确，国内外学者提出的主要假说有上皮肌上皮岛假说、病毒诱导假说、自身免疫功能障碍假说、性激素紊乱假说、蛋白紊乱假说、IgG4浸润假说等[3]，但均不能阐述其确切的发病机制。随着对该病深入研究，目前认为该病可能是一种IgG4相关性疾病。本研究拟观察泪腺BLEL的组织病理学变化及IgG4、C3在泪腺BLEL患者泪腺组织中的表达，探讨泪腺BLEL的病理特点及其可能的发病机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取2010年7月至2018年5月在承德医学院附属医院眼科及解放军总医院眼科就诊并手术切除经病理检查确诊为泪腺BLEL的患者共15例15眼(试验组)，其中男9例、女6例，所有患者术前均未接受化学药物治疗和免疫治疗，年龄为41～71(56.80±9.26)岁。另外，选取2010年7月至2018年5月于解放军总医院眼科因其他疾病而行眶内容物摘除术患者的正常泪腺组织，未被病变侵及或有原发病的患者10例10眼作为对照组。入选标准：病变与泪腺无相关性，影像学、术中所见及术后病理均证实泪腺结构正常，其中男3例、女7例，年龄为12～65(46.50±18.05)岁。2组患者年龄、性别比较，差异均无统计学意义(均为P>0.05)。

纳入及排除标准参考文献[4]。BLEL的诊断标准：(1)泪腺对称性持续性肿大合并一侧或两侧颌下腺和(或)腮腺肿大；(2)排除有上述表现的其他疾病，如淋巴瘤、类肉瘤、病毒感染、淋巴增生性疾病等。本研究取得承德医学院附属医院、解放军总医院第三医学中心伦理委员会批准，所有患者对本研究知情同意，并签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 HE染色观察泪腺标本组织结构及病理形态2组患者的手术标本均用中性甲醛固定、石蜡包埋后在病理科存档，将蜡块切成厚5 μm的切片，65 ℃温箱烤片30 min，二甲苯脱蜡2次，每次10 min。梯度酒精脱水各5 min，水洗、高清恒定液、苏木素染色5 min，流水冲洗2 min，分化液2 s、流水冲洗1 min、返蓝液2 min、自来水冲洗2 min、伊红染液5 min、无水乙醇3次，每次3 min，二甲苯3次、每次3 min，中性树胶封固。光镜下拍照泪腺标本组织结构。

1.2.2 免疫组织化学染色观察泪腺组织中IgG4和C3表达采用免疫组织化学方法检测2组标本中IgG4、C3的表达水平，一抗为Abcam公司生产的兔抗人C3单克隆抗体[抗C3抗体(EPR19394)，产品编号：ab200999，11000稀释]和兔抗人IgG4单克隆抗体[抗IgG4抗体(EP4420)，产品编号：ab109493，11000稀释]，二步法试剂盒为北京中杉金桥生物技术有限公司生产的通用型SPkit快捷免疫组织化学试剂盒(产品编号：SP-9001)。阴性对照：PBS代替一抗。实验步骤：石蜡块厚5 μm切片，烤片，二甲苯脱蜡2次，乙醇梯度水化，利用H2O2消除内源性过氧化物酶，微波炉抗原修复，山羊血清封闭，滴加一抗4 ℃冰箱过夜，生物素标记山羊抗兔IgG的二抗孵育，辣根酶标记的链霉卵白素工作液孵育，DAB显色，苏木精复染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，光镜下拍照(×400、×200)。采用Image-Pro Plus软件计算试验组及对照组阳性表达面积/HP。判定标准：DAB显色中IgG4以胞浆染成棕黄色为阳性，C3以胞膜出现棕黄色为阳性。在显微镜下观察每份标本(随机观察5个40×10倍视野)，对每个视野阳性面积进行统计后取5个视野阳性表达面积的平均值。

2 结果

2.1 2组患者泪腺组织病理学HE染色结果光镜下检查可见：对照组泪腺由正常腺泡及导管组成，导管上皮细胞排列整齐，细胞结构清晰，其间有少量的淋巴细胞。试验组病变的泪腺组织在光镜下可见泪腺的腺体不同程度萎缩和破坏，大量淋巴细胞及浆细胞浸润，淋巴滤泡形成，淋巴组织中可见小岛状导管上皮增生结构改变(上皮-肌上皮岛)，同时伴有不同程度纤维化(图1)。

2.2 2组患者泪腺免疫组织化学染色检测结果免疫组织化学染色结果：IgG4免疫球蛋白阳性产物主要位于浆细胞胞浆及部分淋巴细胞胞浆中，呈棕黄色颗粒状，免疫阳性细胞主要散在分布于淋巴细胞中，IgG4在试验组中表达[(30 934.80±16 057.17)像素]明显高于对照组[(325.42±204.43)像素]，差异有统计学意义(t=-7.38，P=0.000)。见图2。

C3蛋白免疫阳性产物主要位于淋巴细胞的胞膜，呈棕黄色颗粒状，试验组中表达[(43 169.49±33 206.60)像素]明显高于对照组[(323.24±271.29)像素]，差异有统计学意义(t=-5.00，P=0.000)。见图3。

试验组中IgG4与C3表达相关分析显示，二者的表达无相关性(r=-0.137，P=0.671)。

图1 2组患者泪腺组织HE染色结果。A：对照组可见泪腺由正常腺泡及导管组成，导管上皮细胞排列整齐，细胞结构清晰，其间有少量的淋巴细胞(HE，×200)；B：试验组可见泪腺BLEL的淋巴滤泡病理性改变(HE，×100)；C：试验组可见泪腺BLEL的纤维化病理性改变(HE，×200)。D：试验组可见泪腺BLEL的萎缩，大量淋巴细胞、浆细胞浸润(HE，×200)

图2 2组IgG4阳性产物表达(SP法，×400)。A：试验组IgG4阳性产物主要位于浆细胞胞浆、部分淋巴细胞胞浆中，呈棕黄色颗粒状，免疫阳性细胞主要散在分布于淋巴细胞中；B：对照组少量散在分布的IgG4阳性表达产物

图3 2组C3蛋白免疫阳性产物表达(SP法，×400)。A：试验组C3蛋白免疫阳性产物主要位于淋巴细胞的胞膜，呈棕黄色颗粒状；B：对照组C3蛋白免疫阳性产物少量散在分布于淋巴细胞的胞膜，呈棕黄色颗粒状

3 讨论

BLEL是一种以淋巴细胞弥漫性浸润多个腺体，同时腺体内肌导管上皮细胞反应性增生为特征的良性病变[5]，常累及多个器官或组织，泪腺BLEL是一种极具代表性的BLEL。本研究以正常泪腺作为对照组，正常泪腺组织病理学表现为泪腺由腺泡和导管组成，导管上皮细胞排列整齐，细胞结构清晰，其间有少量的淋巴细胞；试验组泪腺出现不同程度的萎缩、破坏，甚至正常滤泡、导管、细胞结构消失，大量淋巴细胞及浆细胞浸润，淋巴滤泡、上皮-肌上皮岛形成，伴有纤维化，表现出与正常泪腺具有显著差异的病理形态学改变。既往的研究只对泪腺BLEL进行病理形态学描述，无正常泪腺组织病理形态的对比性观察，本研究首次将泪腺BLEL同正常泪腺病理形态学表现同时进行描述，更确切地揭示了泪腺BLEL的发病机制。

泪腺BLEL的发病机制至今尚未完全明确，目前有学者认为其可能是一类IgG4相关性疾病[6-7]，而C3介导的补体途径的激活可能与其发生发展密切相关。IgG4相关性疾病是一种由免疫系统介导的系统性、慢性自身免疫性炎性疾病，该病的主要临床特征是受累器官肿胀、纤维化和硬化，患者血清中IgG4水平显著增高，受累组织和器官大量淋巴细胞浸润，形成生发中心，特别是IgG4阳性浆细胞浸润突出[8]。在IgG4相关性疾病中，Kakudo等[9-10]发现，甲状腺炎组织病理出现淋巴细胞浸润、间质纤维化、IgG4阳性浆细胞升高等典型改变，并且认为IgG4的高表达与组织病理学改变相关。Yamada等[11]对泪腺BLEL患者外周血进行相关检测后发现，无论病变累及的是组织，还是外周血，均存在IgG4阳性多克隆的细胞，可以解释BLEL作为一种IgG4相关性疾病所呈现的一些临床表现。既往的研究采用海绵状血管瘤作为对照组，未见有学者采用正常泪腺组织研究IgG4、C3表达情况的。本研究以正常泪腺作为对照组，结果发现与对照组相比，试验组病变泪腺中IgG4表达明显升高，差异有统计学意义，这同其他学者研究结果一致[12-14]，这表明 IgG4可能参与了泪腺BLEL的发生发展。

补体系统是人体精细调节，在激活与灭活之间形成动态平衡，当出现调节异常后，打破这种动态平衡可造成自身组织损伤。补体系统是人体重要的免疫组成部分，而C3蛋白是补体系统中不仅含量最高，而且在激活补体途径上起到枢纽作用。正常情况下，多数补体成分以非活化形态存在，当宿主遭受感染防御过程中，补体系统起着重要作用，即通过经典途径、旁路途径、凝集途径，经过一系列蛋白水解级联反应形成最终的攻膜复合体，导致靶细胞裂解[15-16]。Li等[17-18]研究发现，泪腺BLEL与眼眶海绵状血管瘤患者病变组织进行差异基因筛选，结果显示补体受体介导的信号通路表达丰度最高，同时伴有T细胞和B细胞信号通路的上调以及丝裂原激活蛋白激酶和转化生长因子-β信号通路的下调。在本研究中，试验组病变泪腺中C3表达明显高于对照组正常泪腺，说明在泪腺BLEL中补体系统被激活，提示C3与泪腺BLEL的存在密切相关。值得关注的是，有学者认为IgG4并不通过经典途径激活补体系统，而是通过旁路途径和部分IgG4具有结合活化凝集素途径激活补体系统[19-20]。本研究中，IgG4和C3表达并未见相关性，我们考虑在泪腺BLEL中IgG4并未激活补体系统或者激活补体系统的因素中IgG4只是非主要因素，存在目前未知的因素。

综上所述，泪腺BLEL发生了正常结构萎缩，大量淋巴细胞、浆细胞浸润等组织病理学改变，这可能与IgG4的高表达及补体系统的激活有关，但IgG4与补体系统之间是否存在“交互作用”仍需进一步探讨。