外周血液中miRNA表达与老年性黄斑变性相关性研究

朱美江 任成达 蔡雯婷 梁秀玮 金惠子 张瑞玲 刘畅 范佳淇 沈天怡 于靖

老年性黄斑变性(age-related macular degeneration，AMD)是目前老年人视力受损和致盲的最主要原因之一。除年龄外，遗传基因、吸烟史、视网膜慢性光损伤以及营养摄入不良等都是AMD相关危险因素。AMD根据病理类型分为干性AMD和湿性AMD，湿性AMD的病理变化是形成脉络膜新生血管(choroidal neovascularization，CNV)[1]。目前临床上主要通过玻璃体内注射抗血管内皮生长因子治疗湿性AMD，虽然有一定疗效，但是无法有效治愈[2]。AMD患者主要依据症状、眼底照相、光学相干断层扫描(optical coherence tomography，OCT)以及荧光素眼底血管造影(fundus fluorescein angiography，FFA)明确诊断[3]，而干性AMD患者早期不出现明显的视力下降，很难在早期诊断并进行有效的治疗，约10%的患者会进展到湿性AMD。目前，尚没有研究发现如何预防干性AMD发展成湿性AMD，因此，如何早期发现进展的干性AMD，并及时阻断疾病进展，显得尤为重要。

微小核糖核酸(microribonucleic acid，miRNA)是一类长度为21～25个核苷酸的非编码核苷核酸(ribonucleicacid，RNA)[4]，通过剪辑互补原则结合到靶信使核糖核酸(messageribonucleicacid，mRNA)3’非翻译区(3’untranslatedregion，3’UTR)，诱导mRNA降解或阻止其翻译进行，从而调控目的基因的表达。越来越多的研究表明，miRNA参与细胞增殖，凋亡、死亡和细胞分化等一系列生物学进程。Karali等[5]研究发现，miRNA参与调控视网膜的发育和视网膜疾病的进展[6]，并且miRNA表达异常与AMD病程相关[7]。多项研究也证明了外周循环血中miRNA对于疾病的早期诊断具有重要的作用[8-9]。本研究通过基因芯片技术检测AMD患者外周血中miRNA表达水平与AMD病程进展的相关性，并采用实时定量逆转录聚合酶链式反应(real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction，RT-qPCR)的方法定量分析AMD患者血液中的miRNA表达水平，旨在发现对于早期诊断AMD具有参考价值的miRNA。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取2014年1月至2016年11月同济大学附属第十人民医院眼科门诊就诊的6例AMD患者作为试验组，其中男4例，女2例，年龄(68.5±7.8)岁。AMD诊断依据为年龄>50岁，眼底散在玻璃膜疣、视网膜脉络膜萎缩、出血伴新生血管，经OCT以及FFA确诊[10]。同期选取6名年龄和性别与之相匹配的正常老年人为对照组，其中男4人，女2人，年龄(65.7±6.9)岁，两组年龄差异无统计学意义(P>0.05)。扩大样本的病例对照研究中纳入了126例AMD患者和140名健康受试者，AMD组男67例，女59例，年龄(58.4±11.2)岁，其中包括72例干性AMD患者及54例湿性AMD患者；健康受试组男74人，女66人，年龄(54.9±10.7)岁。两组性别与年龄差异均无统计学意义(均为P>0.05)。

1.2 纳入与排除标准纳入标准[10]：(1)眼底彩色照相有融合的边界不清的玻璃膜疣，黄斑区视网膜下出血；(2)OCT表现为视网膜色素上皮/脉络膜毛细血管层的红色反射光带，局限性增厚；(3)FFA呈现透见荧光时，表现为视网膜色素上皮萎缩，色素沉着处可有遮蔽荧光，后期有荧光素渗漏。排除标准[11]：(1)高度近视，近期诊断为结膜炎、角膜炎或葡萄膜炎；(2)黄斑裂孔患者、黄斑水肿、视网膜血管闭塞或中心性浆液性脉络膜视网膜病变；(3)近期确诊的感染、高血压、糖尿病、癌症、阿尔茨海默病、中风、自身免疫性疾病等器质性病变；(4)任何未完成相关检查或调查的患者。

1.3 方法

1.3.1 RNA提取用肝素抗凝管分别采集试验组及对照组外周静脉血0.5 mL，加入TRIzol试剂(Invitrogen，Carlsbad，CA，美国)1 mL。室温放置5 min，转移至灭菌的2 mL离心管中，12 000 r·min-1离心5 min，弃沉淀，加入0.2 mL氯仿，混匀后室温放置15 min。4 ℃ 12 000 r·min-1离心5 min，吸上层水相加入另一离心管，加入0.5 mL异丙醇，混匀后室温放置5～10 min，4 ℃ 12 000 r·min-1离心10 min，RNA沉于管底，弃上清，加入1 mL体积分数为75%乙醇悬浮沉淀，4 ℃ 8000 r·min-1离心5 min，尽量弃上清，空气干燥沉淀，溶解于20 μL DEPC水中，留样2 μL定量，其余-70 ℃保存。使用NanodropND-2000分光光度计(Thermo Scientific，Worcester，MA，美国)测定RNA的纯度。

1.3.2 基因芯片技术分析通过miRCURYTMHy3TM/Hy5TM标记试剂盒将经过质量检测的两组全血样本总RNA进行靶标制备，与miRCURYTM核苷酸芯片进行芯片杂交。清理基因芯片后，用分析系统(genepix Pro 6.0软件，Axon)分析所有芯片，选取每张芯片上修正值都≥30的非对照探针做标准化，以这部分探针中值(median，M)作为标准化因子对整张芯片的点做标准化处理，即各个miRNA修正值/M=标准值。

1.3.3 RT-PCR分析用Taqman miRNA检测方法检测两组全血样品中miRNA的表达。使用Applied Biosystem(Foster City，CA，USA)逆转录试剂盒中的试剂、引物和探针。取12份全血总RNA(120 ng)分别加入含有逆转录混合物和引物的15 μL反应体系中。混匀后94 ℃孵育2 min，94 ℃进行20 s，60 ℃进行34 s。所有实验均使用Mx3005P qPCR系统(Agilent，Santa Clara，CA，美国)进行。用18 S RNA作内参数据，通过比较循环阈值(2-ΔΔCT)计算miRNA的相对表达量。使用线性模型微阵列数据分析来自微阵列或转录组测序技术的基因表达数据[12]。

1.3.4 生物信息学分析通过miRBase(http：//www.ebi.ac.uk/enright-srv/microcosm/htdocs/targets/v5/Microcosm)、Miranda(http：//www.microrna.org/microrna/ home.do hg19，Miranda)和targetscan(http：//www.targetscan.org/vert_60/)等基因库预测miRNA的目的基因。使用GO条目、“京都基因和基因组百科全书”分析绘制基因本体注释图，并标注目的基因。

1.3.5 数据分析使用SPSS 16.0进行数据分析。通过双尾测验分析试验组与对照组之间外周血中miRNA的表达量差异。数据以均数±标准差表示。通过受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic，ROC)分析验证多种miRNA(尤其是上述三种表达量明显差异的miRNA)的诊断效果，并计算灵敏度和特异度。检验水准：α=0.05。

2 结果

2.1 miRNA表达量差异基因芯片分析结果显示，与对照组相比，试验组中216个外周血miRNA的表达水平存在差异，其中111个miRNA表达量上升，105个miRNA表达量下降，差异均有统计学意义(均为P<0.05)。由于表达量不同的miRNA数量较多，将P值设定为小于0.05，且差异倍数大于两倍作下一步分析。在此条件下共筛选出35个差异表达的miRNA，其中15个miRNA表达量上升，20个miRNA表达量下降，差异均有统计学意义(均为P<0.05)。见表1。

2.2 生物信息学分析GO分析了调控不同信号通路的相关靶基因，与生物过程相比，调控细胞过程、单一生物过程和代谢过程相关通路的基因表达量显著改变，这意味着表达量异常的miRNA主要参与调控上述的生物学过程。为了明确具体通路，进行了miRNAs靶基因的通路分析(数据库：http：//www.kegg.jp/)。结果显示，细胞周期通路与AMD的相关性最高，相关程度明显高于其他相关通路。这表明细胞周期失调可能参与AMD疾病发展过程。

2.3 扩展性病例研究结果对照试验从微阵列测量结果中选取10个miRNA(miR-152、miR-27a-3p、miR-28-5p、miR-195-5p、miR-559、miR-25-3p、miR-29b-3p、has-let-7c、miR-328和miR-584-5p)进行对比。与健康受试组相比，AMD组中miR-27a-3p、miR-29b-3p和miR-195-5p的表达明显增加，分别增加(2.68±1.00)倍、(3.53±1.78)倍和(4.23±3.08)倍。而其他miRNA两组差异均无统计学意义(均为P>0.05)。见图1。

2.4 miRNA的表达量差异与AMD病程相关性进一步验证上述3种miRNA的表达量，在湿性AMD患者中miR-27a表达量比干性AMD患者中更高，而miR-29b-3p和miR-195-5p表达量两组差异均无统计学意义(均为P>0.05)。见图2。

表1 基因芯片技术分析得出miRNA表达量差异

名称表达水平差异倍率hsa-miR-644b-5p上升4.92hsa-miR-559上升3.71hsa-miR-152上升3.66hsa-miR-195-5p上升3.41hsa-miR-27a-3p上升2.63hsa-miR-126-5p上升2.51hsa-miR-4638-5p上升2.43hsa-miR-28-5p上升2.34hsa-let-7c上升2.33hsa-miR-5189上升2.29hsa-miR-1273f上升2.15hsa-miR-513b上升2.08hsa-miR-25-3p上升2.07hsa-miR-149-3p上升2.01hsa-miR-29b-3p上升2.00hsa-miR-513c-3p下降0.47hsv2-miR-H9-3p下降0.46hsa-miR-30c-1-3p下降0.46hsa-miR-4723-3p下降0.46hsa-miR-3614-3p下降0.45hsa-miR-3195下降0.45hsa-miR-4305下降0.45hsa-miR-328下降0.44hsa-miR-4324下降0.41hsa-miR-4658下降0.41hsa-miR-584-5p下降0.38hsa-miR-2114-5p下降0.38hsa-miR-186-3p下降0.38hsa-miR-5571-5p下降0.38hsa-miR-18b-3p下降0.36hsa-miR-4667-3p下降0.34hsa-miR-4436b-5p下降0.33hsa-miR-4653-3p下降0.31hsv1-miR-H14-3p下降0.29hsa-miR-1470下降0.13

图1 AMD组与对照组血清中差异表达的miRNA。**P<0.01，***P<0.001

2.5 miRNA表达量差异的诊断效果用ROC进一步分析了126例AMD患者和140名健康受试者样本中3种miRNA表达量差异的诊断效果。通过RT-PCR方法检测每个参与者的miR-27a-3p、miR-29b-3p和miR-195-5p表达水平，将数据输入SPSS软件，用ROC曲线表示表达量不同的miRNA的诊断效果。根据ROC曲线分析发现，3种miRNA都可以作为AMD的诊断标记物。miR-27a-3p(图3A)、miR-29b-3p(图3B)和miR-195-5p(图3C)的ROC面积分别为0.925(95%CI=0.892～0.963)和0.757(95%CI=0.679～0.832)和0.766(95%CI=0.672～0.813)。该结果显示，外周血中的miR-27a-3p、miR-29b-3p和miR-195-5p具有作为AMD诊断的生物标志物的可能性。当miR-27a-3p≥12.0时，灵敏度为0.825，特异性为0.728；当miR-29b-3p≥10.6时，灵敏度为0.688，特异性为0.718；当miR-195-5p≥10.2时灵敏度为0.726，特异性为0.596。

图2 miR-27a、miR-29b-3p和miR-195-5p在干性AMD、湿性AMD与对照组中的表达

图3 miR-27a-3p、miR-29b-3p和miR-195-5p诊断AMD的ROC曲线。A：miR-27a-3p的ROC曲线；B：miR-29b-3p的ROC曲线；C：miR-195-5p的ROC曲线

3 讨论

AMD是50岁以上人群不可逆视力丧失最主要的原因之一。干性AMD患者早期仅出现轻度症状，但进展为湿性AMD时，患者的视力严重受损。目前，针对湿性AMD主要是通过抗VEGF药物治疗，而对于干性AMD，多使用抗氧化剂延缓其症状发展，因此寻找AMD早期诊断和预后的有效指标尤为重要[13]。本研究发现，miR-27a-3p、miR-195-5p和miR-29b-3p在AMD患者中的表达量存在明显差异，因此，外周血中miRNA可能成为湿性AMD早期诊断的生物标志物。本研究还弥补了AMD病例中外周血miRNA高通量分析的缺失，发现AMD患者中miRNA水平的变化情况，对于AMD生物标志物的研究具有重要的作用。

目前已发现miRNA调节多种细胞功能并参与多种细胞通路。视网膜细胞功能紊乱是导致AMD疾病进展的关键因素。近期的研究表明，miRNA，如miR-17、miR-21、miR-27、miR-132、miR-204、miR-210、miR-296、miR-378、miR-519c和miR-15/107等都与AMD的病程发展有关[14-15]。眼内miRNA的失调可能同时导致血液中miRNA表达量的差异。因此，研究外周血中miRNA在AMD患者中的表达量差异对于发现AMD疾病的无创生物标志物具有重要意义。本研究利用基因芯片技术显示，AMD组与对照组中外周血miRNA的表达量差异，共检测到35种变化倍率大于2的miRNA(15种miRNA表达量上调和20种miRNA表达下调)，考虑到miRNA表达的个体化差异，从中选择10个表达量水平显著且稳定的miRNA，其余miRNA有待进一步验证。生物形态学分析表明，外周血中miRNA表达量差异主要与细胞进程，生物调控和代谢过程有关，同时表明细胞功能失调是AMD的主要发病机制。此外，靶基因的功能富集分析表明，细胞周期通路在AMD发病机制中百分比最大。通路分析的结果证实了AMD患者中的细胞功能失调。然而，目前尚无一项完整的关于AMD进展与细胞周期功能障碍的研究。因此，本研究的结果将为AMD疾病研究进展提供新的方向。

尽管微阵列谱具有快速、稳定和高通量结果的优点，但其包含的样本容量较少。因此，我们进行了扩大样本的病例对照试验进行验证。从基因芯片分析结果中选出10个miRNA (miR-152、miR-27a-3p、miR-28-5p、miR-195-5p、miR-559、miR-25-3p、miR-29b-3p、has-let-7c、miR-328和miR-584-5p)用于进一步验证，发现其验证结果与miRNA基因芯片试验结果相一致。在10个选定的miRNA中，三个miRNA检测到统计学差异。与健康受试组相比，AMD组中miR-27a-3p、miR-29b-3p和miR-195-5p表达量分别为2.68、3.53和4.23倍。其中miR-27a-3p在干性和湿性AMD组之间同样表现出表达量水平差异，提示miR-27a-3p更具有作为AMD疾病进展生物标志物的潜力。3种miRNAs的ROC曲线分析也显示这3种miRNAs可以作为AMD的生物标志物。同时miR-27a-3p也表现出最高的灵敏度(0.825)和最高的特异性(0.728)。

目前尚没有研究发现miR-27a-3p、miR-29b-3p和miR-195-5p在AMD的发病中发挥作用。本研究发现湿性AMD中miR-27a-3p的表达高于干性AMD，miR-27a-3p表达量上调可能与湿性AMD的CNV生成有关。miR-29-3p和miR-195-5p分别位于染色体18和17上，这两种miRNA参与细胞分化和肿瘤形成[16]，在多种疾病的诊断与治疗中发挥作用[17]。后续试验将重点研究上述三种基因与AMD病程之间的关系。

本研究尚有一些不足之处。首先，样本量较小；其次，本研究缺乏长期的随访资料，很难确定循环miRNA在AMD疾病发展中的预后效应；第三，尽管本研究中发现了几种具有潜在作用的特异性miRNA，但详细的机制还有待进一步研究。考虑到本研究的数据是基于AMD患者的全血样本，外周血中miRNA含量的变化可能不完全符合局部变化，在进行进一步的体外研究之前应进行更多的分析。因此，在后续的研究中将扩大样本量，并进行组织和血样中miRNA表达量的比较，进一步研究miRNAs在AMD发病机制中的确切作用。