红芪多糖干预内毒素诱导的大鼠葡萄膜炎的机制△

王婧 刘新丽 吴慧茹 贾辉钰 卢弘

葡萄膜炎是常见的眼部炎性疾病，它具有起病急、症状重、复发率高、并发症重等特点，最终导致不可逆的视力损害。对该病的发生、发展、治疗及预后的研究成为一项重大课题。国内外对葡萄膜炎的研究集中在感染与免疫领域，糖皮质激素及免疫抑制剂是首选的治疗药物，但此类药物副作用大，停药后病情易反复，常导致严重并发症的发生。因此，深入研究葡萄膜炎的发病机制，寻找新型靶向治疗药物是目前葡萄膜炎治疗的研究热点。Chen等[1]研究发现，在内毒素诱导的葡萄膜炎动物模型中，虹膜与睫状体中的巨噬细胞大量活化，形态发生明显改变，且巨噬细胞表面Toll 样受体4(Toll-like receptor 4，TLR-4)表达明显上调，提示TLR-4信号转导途径可能在葡萄膜炎的发生发展中起到重要作用。Wang等[2]通过对野生型C3H/HeN小鼠和C3H/HeJ(TLR-4基因缺陷型)小鼠的研究发现，TLR-4基因缺陷型小鼠或使用TLR-4单克隆抗体MTS510对野生型小鼠进行阻断后，其炎症程度明显降低，进一步说明TLR-4在葡萄膜炎发病中的重要作用。内毒素-TLR4信号通路有髓样分化因子88 (myeloid differentiation factor 88，MyD88)依赖途径和非MyD88依赖途径[3]，那么葡萄膜炎究竟是通过哪条途径发生的?可否通过干扰或者阻断TLR-4信号转导来减轻甚至治疗炎症呢? 直接阻断TLR-4的活性虽然可以抑制炎症反应途径的发展，但在生物的有机整体中，阻断TLR-4 同时可影响其在免疫调节中的有益作用，最终导致一系列负性作用。因此，在下游更具有靶向性地阻断炎症信号通路显得尤为重要。近年来，祖国传统中药多糖因具有增强机体免疫功能及抗肿瘤等药理作用，引起国内外学者的广泛关注。红芪多糖(hedysarum polybotrys saccharide，HPS)是红芪的主要有效成分。研究发现[4-8]，HPS干预炎症小鼠模型后可明显抑制肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白细胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)和核因子-κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)等多种炎症因子的表达。

本实验拟通过建立内毒素诱导的葡萄膜炎(endotoxin induced uveitis，EIU)动物模型，检测TLR4-MyD88信号转导通路下游分子肿瘤坏死因子受体相关因子6(tumor necrosis factor receptor-associated factor 6，TRAF6)的表达，寻找HPS治疗葡萄膜炎的可能的靶点。通过检测非MyD88依赖途径下游分子TIR功能区接头蛋白诱导的干扰素β(TIR-domain-containing adapter-inducing interferon-β，TRIF)在EIU中的表达情况，探究非MyD88依赖途径在葡萄膜炎中的作用。研究HPS对TRAF6及TRIF表达的影响，进一步探究HPS在TLR4信号转导通路中的作用及其在葡萄膜炎发病过程中的干预机制，以期找到治疗葡萄膜炎的新型治疗药物，为葡萄膜炎的防治提供新思路。

1 材料与方法

1.1 实验动物成年雄性SPF级封闭Wistar大鼠40只，8～10周龄，体质量180～200 g，购于北京维通利华实验动物科技有限公司。动物饲养于清洁动物室，可自由摄取食水，室内恒温、恒湿，并给予12 h光照和12 h黑暗交替循环条件下饲养，减少外界环境刺激因素。本实验遵循实验动物研究指南(实验动物使用与喂养的指导方法)。

1.2 主要试剂霍乱弧菌内毒素(18001株，古典生物型，小川血清型，兰州生物制品研究所)。HPS(兰州大学药理学实验室)，HPS由1.31%鼠李糖、26.49%树胶醛糖、17.51%木糖、43.69% 葡萄糖、1.01%半乳糖5种单糖组成。RT-PCR试剂盒[ReverTra Ace qPCR RT Master Mix (FSQ-201)，SYBR®Green Realtime PCR Master Mix (QPK-201)](上海Toyobo生物有限公司)。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3 主要仪器和设备7500 Real time-PCR系统(Applied BioSystems,加拿大)，眼前节照相系统(日本Topcon 公司)，光学显微镜(德国Leica 公司)，酶标仪(美国Bio-RAD公司)。

1.4 动物模型的建立及分组将霍乱弧菌内毒素溶于生理盐水中，配制成2 g·L-1的注射液。将HPS溶解于生理盐水中，配制成40 g·L-1的注射液。40只大鼠随机分为4组：正常对照(normal control,NC)组、EIU模型组、HPS+内毒素组和HPS组，每组10只。EIU模型组大鼠采用皮下注射1 mg·kg-1内毒素的方法建立EIU动物模型，NC组给予等量磷酸盐缓冲液皮下注射，HPS+内毒素组大鼠在1 mg·kg-1内毒素皮下注射前1 h给予HPS 400 mg·kg-1腹腔注射，HPS组大鼠只给予腹腔注射HPS 400 mg·kg-1。

1.5 观察炎症反应内毒素注射后每2 h裂隙灯下观察大鼠眼前节炎症反应严重程度，按文献[7]中的评分标准，在注射后0 h、6 h、12 h、18 h、24 h评估大鼠眼部临床炎症反应严重程度。24 h后，腹腔注射戊巴比妥钠(100 mg·kg-1)处死各组大鼠，立即于显微镜下取大鼠眼球，置于体积分数4%福尔马林液中浸泡过夜。梯度乙醇脱水，石蜡包埋大鼠眼球，沿瞳孔-视神经轴做组织切片进行HE染色。

1.6 RT-PCR分析显微镜下分离大鼠虹膜睫状体组织，参照使用说明用TRIzol®(Invitrogen,美国) 试剂提取虹膜睫状体组织总RNA。按照试剂盒步骤合成cDNA，并使用7500 Real time-PCR系统进行RT-PCR。每个样本中同时检测β-actin的表达，以使数据标准化。RT-PCR引物为自行设计，序列见表1。每个样本重复3次，使用域循环值(CT)进行计算，采用ΔΔCT方法定量测量NF-κB p65、TRAF6及TRIF基因的表达水平。

1.7 统计学分析采用SPSS 19.0统计学软件进行数据分析，实验数据结果用均数±标准差表示。采用单因素方差分析，多重比较采用LSD，检验水准：α=0.05。

表1 引物序列

基因引物序列TRAF6上游引物:5’-GAGAGATTCTTTCCCTGACGGTA-3’下游引物:5’-GCGAGATCACTAAACAGGGGTT-3’TRIF上游引物:5’-ATTCAGTAAGGAGCAGTAATAGGA-3’下游引物:5’-TCACAGGGAATACAGTTCTCAGTT-3’NF-κB p65上游引物:5’-GGTTACGGGAGATGTGAAGATG-3’下游引物:5’-TGTGAATCGGTAGTAGGTGGAA-3’β-actin上游引物:5’-CTGAGAGGGAAATCGTGCGT-3’下游引物:5’-ATAGCCGTTACTCGCCAAGG-3’

2 结果

2.1 各组大鼠炎症表现NC组大鼠24 h内眼前节未见炎症反应。EIU模型组大鼠注射内毒素24 h后可见虹膜血管扩张明显，瞳孔区大量白色渗出。HPS组大鼠注射HPS 24 h后仅可见虹膜血管扩张，未见其他眼部炎症反应。HPS+内毒素组大鼠注射内毒素24 h后眼前节表现为虹膜血管扩张和瞳孔缘少量渗出。具体见图1。

图1 各组大鼠眼前节表现。A:NC组：24 h内眼前节未见炎症反应；B:EIU模型组：注射内毒素24 h后可见虹膜血管扩张明显，瞳孔区大量白色渗出(箭头)；C:HPS组：注射HPS 24 h后仅可见虹膜血管扩张(箭头)，未见其他眼部炎症反应；D:HPS+内毒素组：注射内毒素24 h后可见虹膜血管扩张，瞳孔缘少量渗出(箭头)

2.2 眼部临床炎症反应评分结果EIU模型组大鼠眼部炎症反应于内毒素注射后24 h达高峰。注射后24 h，EIU模型组、HPS+内毒素组、HPS组与NC组大鼠眼部临床炎症评分比较，差异均有统计学意义(均为P<0.001)；HPS+内毒素组、HPS组与EIU模型组比较，差异均有统计学意义(P=0.012、0.003)；HPS+内毒素组与HPS组比较，差异有统计学意义(P<0.001)。EIU模型组内不同时间点眼部临床炎症评分比较可见，注射后0 h与其余各个时间点比较差异均有统计学意义(均为P<0.001)，注射后6 h、12 h、18 h与24 h比较差异均有统计学意义(均为P<0.05),余注射后各时间点两两比较差异均无统计学意义(均为P>0.05)。HPS+内毒素组内比较发现，注射后0 h与其余各个时间点比较差异均有统计学意义(均为P<0.001)，注射后6 h、12 h、18 h与24 h比较差异均有统计学意义(均为P<0.05)，余注射后各时间点两两比较差异均无统计学意义(均为P>0.05)。HPS组内比较发现，注射后0 h与6 h、12 h、18 h、24 h比较差异均有统计学意义(均为P<0.05)；余注射后各时间点两两相比差异均无统计学意义(均为P>0.05)。见表2。

2.3 HE染色结果NC组前房内无炎性细胞浸润；EIU模型组大鼠可见大量中性粒细胞、少量单核细胞及淋巴细胞浸润于前房及睫状体组织内。HPS组及HPS+内毒素组大鼠前房内均见少量炎性细胞浸润。见图2。

表2 各组不同时间点眼部临床炎症反应评分

组别临床炎症反应评分/分0 h6 h12 h18 h24 hNC组0±00±00±00±00±0EIU模型组0±02.60±0.843.80±0.923.40±1.175.70±1.34HPS组0±01.40±0.700.70±0.601.00±0.671.10±0.57HPS+内毒素组0±01.80±0.792.40±1.072.40±0.973.30±0.67

2.4 NF-κB p65、TRAF6及TRIF mRNA的表达注射内毒素后24 h，NF-κB p65 mRNA的表达水平在EIU模型组最高，在HPS+内毒素组中的表达较EIU模型组明显减少(P<0.001)，在HPS组中的表达较NC组高但低于EIU模型组和HPS+内毒素组，差异均有统计学意义(均为P<0.001)。TRAF6 mRNA的表达量EIU模型组较NC组明显增加，HPS+内毒素组较EIU模型组明显降低，HPS组显著低于NC组，差异均有统计学意义(均为P<0.001)。TRIF mRNA在NC组的表达水平最高，但各组间表达量差异无统计学意义(P=0.236)。见图3。

图2 各组眼球HE染色结果。A:NC组；B:EIU模型组；C:HPS+内毒素组；D：HPS组

3 讨论

葡萄膜炎是常见的眼部炎症性疾病，也是致盲的主要因素之一，其复杂的发病机制目前尚未完全明确。因人体取材的局限性，对EIU动物模型的研究为明确葡萄膜炎的发病机制及临床治疗奠定了重要的实验基础。该葡萄膜炎模型的病理特点、炎症信号通路及阻断机制是目前研究的热点。大量的实验研究表明，内毒素可以诱导大鼠虹膜睫状体组织中TLR4及MyD88表达水平的增高，进而激活其下游通路分子并产生一系列炎症病理反应[1-2]。

红芪系豆科岩黄芪属植物多序岩黄芪的根，为西北特产，尤以甘肃产最佳。作为传统中药，红芪在中医临床上主要用于益气固表、利尿、排毒等。HPS通过分步醇沉淀和凝胶柱色谱两种分离方法提纯获得，作为红芪的主要活性物质，HPS能够增强过氧化物歧化酶的活性，进而增强机体免疫力，并加强淋巴因子激活的杀伤细胞对肿瘤细胞的杀伤作用[9]。对HPS的亚慢性毒性实验显示，HPS对实验动物无毒性作用，最大至800 mg·kg-1剂量的HPS口服仍不会造成实验动物死亡或产生毒性反应[8]。

本实验使用Wistar大鼠成功建立EIU模型。通过对EIU模型大鼠临床表现的观察可见，在给大鼠注射内毒素后24 h炎症反应达到高峰。给予HPS腹腔注射后大鼠眼前节炎症表现明显减轻，这表明HPS可抑制EIU模型的炎症反应。TRAF6 mRNA在EIU模型组的表达较NC组明显增加。TRAF6 mRNA表达水平与大鼠临床表现和NF-κB mRNA的表达水平相符，即炎症表现明显时，TRAF6和NF-κB的表达均呈增高状态。HPS对TRAF6和 NF-κB mRNA的表达以及对EIU模型的炎症反应具有明显的抑制作用。

TRAFs中的TRAF2、TRAF5和TRAF6介导了不同途径NF-κB的激活。TRAF6是内毒素、肿瘤坏死因子等刺激物的下游分子，同时也是MyD88依赖途径的下游分子，是TLR4-MyD88-NF-κB信号通路中重要的调节因子。有研究发现[10]，在内毒素激活的NF-κB信号通路中，TRAF6作为泛素化连接酶复合体的一部分，其自身被泛素修饰后，催化转化生长因子β相关激酶泛素化。TRAF6的泛素化是其介导的NF-κB信号通路激活过程中的重要一步，稍后发生的NF-κB α抑制蛋白的磷酸化及泛素化直接活化了转录因子NF-κB。近期的研究发现[11]，TRAF6基因敲除可导致免疫系统和皮肤附属器官如毛囊和汗腺的损伤。作为泛素连接酶复合体的一部分，TRAF6在内毒素激活的NF-κB信号通路中被泛素化修饰而活化[12]，TRAF6在被修饰后介导NF-κB信号通路的激活，最终引起NF-κB的活化并转移进入细胞核[3]，Wang等[2]研究发现，NF-κB的核转移在大鼠葡萄膜炎的发病中起重要作用。本研究结果显示，HPS对TRAF6和NF-κB的表达有明显的抑制作用，且HPS治疗组炎症反应明显减弱，我们推断，HPS对葡萄膜炎的治疗作用与TLR4-MyD88-NF-κB信号通路有关。这与Li等[13]发现的葡萄膜炎的发病与TLR4-MyD88-NF-κB信号通路有关也是相符的。TRAF6作为MyD88依赖途径关键的下游分子，在HPS的影响下表达降低，是否影响其泛素化，进而影响NF-κB的活化？其具体机制是什么？既然HPS可以抑制炎症，那么葡萄膜炎的患者如何用药才更有效？这些将是我们下一步研究的目标。

在TLR4/MyD88 非依赖信号通路中，TLR4通过Toll 样受体相关分子激活TRIF，TRIF立即与接头蛋白绑定，紧接着激活丝裂原激活的蛋白激酶和NF-κB[14]。本研究结果提示，TRIF mRNA在各组中的表达无明显差异。我们认为，TRIF可能没被激活，也与Li等[13]发现的葡萄膜炎的发病与TLR4-MyD88-NF-κB信号通路有关，可能MyD88非依赖途径不起重要作用也是相符的。

综上所述，MyD88依赖性信号转导途径在EIU模型中起到关键作用。HPS可能通过抑制TRAF6发生泛素化修饰从而抑制EIU模型中大鼠眼前节的炎症反应，其具体作用机制有待下一步研究。鉴于其较激素及免疫抑制剂副作用少且价格便宜，口服HPS或者将其制成滴眼液或许给葡萄炎患者的治疗带来福音。