3种试管对磷钼酸法测Vc含量实验的影响

谢 振 资鹏鹏 游清徽 蔡险峰

（江西师范大学生命科学学院食品与生物技术产学研合作示范基地 江西南昌 330022）

“维生素C 的定量测定”是经典的生物化学实验之一，实验教学中常采用2，6-二氯酚靛酚滴定法和碘滴定法，但滴定法易受蔬菜和水果中色素的影响而难以判断滴定终点［1］，且不能排除样品中还原性杂质的干扰，从而增加实验教学难度。磷钼酸法相比于滴定法，具有抗颜色干扰强、专一性高、反应迅速、操作简单等优点，更符合实验教学的要求。但王源秀等［2］指出在实验过程中混合的试剂在30℃水浴时易形成黄色沉淀而影响比色结果，这一缺点限制了磷钼酸法作为“Vc 的定量测定”教学实验方法。

目前，关于磷钼酸法测定Vc 含量的研究多集中在实验条件的优化，不同材质的试管对实验中黄色沉淀产生时间的影响鲜有报导。本文选用质地坚硬且透明的玻璃试管、聚丙烯塑料（PP）试管和聚苯乙烯塑料（PS）试管，作为磷钼酸法测定Vc含量实验的反应容器，探究3 种不同材质试管对实验中沉淀产生时间的影响，旨在为该实验教学筛选维持反应体系稳定性效果最佳的反应容器，为“Vc 的定量测定（磷钼酸法）”实验中反应容器的选择提供指导，最终提高实验教学效果。

1 材料与试剂

1.1 实验材料 玻璃试管（蜀玻集团），PP 试管和PS 试管（世茂实验器材有限公司）

1.2 实验试剂 L-抗坏血酸（阿拉丁试剂公司）；钼酸铵、草酸、EDTA、冰乙酸、偏磷酸等试剂均为分析纯等级（国药集团试剂有限公司）；超纯水（ULUPURE 纯水／超纯水制造系统）。

2 实验方法

2.1 不同材质试管配制标准曲线体系 取玻璃试管、PP 试管和PS 试管各6 支，分别编号0～5，在3 组试管中均按照表1 配制标准曲线反应体系。注意每一步添加试剂后迅速摇匀，所有试剂添加完毕后置于30℃水浴15 min，观察各组在水浴过程中及水浴显色后静置1 h 过程中的沉淀情况，并记录各组试管出现沉淀的时间。实验数据以平均值±标准差（Mean±SD）的形式呈现。

表1 标准曲线制作

2.2 不同材质试管浸出液紫外光谱扫描 在玻璃试管、PP 试管和PS 试管中分别加入6.5 mL 超纯水，封口室温浸泡3 d 和7 d，浸泡液用0.22 μm 滤膜过滤。以鲜制超纯水归零基线，用紫外可见分光光度计（UV-6100，上海元析仪器有限公司）扫描3组浸出液在200～350 nm 波长范围的吸收强度。

3 结果

3.1 不同材质试管组的沉淀情况 在30℃水浴15 min 过程中，玻璃试管组未出现沉淀；PP 试管组和PS 试管组的0～5 号管依次产生沉淀，其中0 号管沉淀时间分别为（161±0.6）s 和（160±0.8）s，5 号试管沉淀时间分别为（897±5.2）s 和（857±4.7）s。Origin 2018 软件线性拟合结果表明，PP 试管组和PS 试管组中各管的Vc 含量与沉淀时间呈线性关系（图1），回归方程分别为y=2.9623x+155.05（R2=0.9966）、y=2.7851x+144.52（R2=0.9972）。

图1 不同试管组的沉淀时间

各组沉淀情况如图2（见封四）所示，玻璃试管组在水浴和静置的过程中保持澄清；PP 试管组和PS 试管组中各试管在水浴过程中都产生了沉淀，且沉淀颜色均呈现由黄色到墨绿色的梯度变化。静置1 h 过程中，PP 组和PS 试管组的各试管产生的黄色沉淀逐渐增加，至静置时间结束后，各管底部可观察到明显的沉淀积累。

图2 不同试管组在不同时间的沉淀情况

3.2 浸出液紫外光谱扫描图谱 各试管组浸出液紫外扫描图谱如图3所示，玻璃试管组3 d 和7 d浸出液在200～350 nm 范围均无明显紫外吸收；PP组和PS 组的3 d 浸出液在200～225 nm 处检测到紫外吸收，7 d 浸出液在200～320 nm 范围内均有强度递减的吸收，且7 d 浸出液紫外吸收强度明显高于3 d 浸出液。同时，PP 组在不同时间浸出液的紫外吸收强度略低于PS 组，该结果与PP 试管组沉淀产生时间略长于PS 试管组情况相符。结果表明，PP 试管和PS 试管在室温条件下以水为溶媒可溶出具紫外吸收的物质，且该条件下溶出物随时间延长而增加，持续溶出时间至少7 d。

图3 浸出液紫外扫描图谱

4 讨论

钼酸铵与偏磷酸在酸性条件下合成黄色磷钼酸铵沉淀，磷钼酸铵沉淀在钼酸铵过量时能在过量的磷钼酸盐溶液中溶解［3］。各组标准曲线体系中存在过量的钼酸铵，因此反应初期产生的磷钼酸铵能溶解，即各组0 号试管中溶液应呈黄色澄清状态。1～5 号管中存在不同含量的还原性Vc，将相应量的黄色磷钼酸铵还原为钼蓝，因此应呈现黄色到墨绿色（黄色和蓝色的复合）的梯度变化。

本研究结果显示（图2），玻璃试管组各管在30℃水浴和静置1 h 的过程中均保持澄清状态，且0～5 号管颜色变化如上所述；PP 试管组和PS试管组各管在水浴15 min 过程均产生大量黄色沉淀，且各管产生沉淀的时间随Vc 含量的增加而增加。PP 试管组和PS 试管组与玻璃试管组相比仅存在反应容器差异，标准曲线反应体系的配制方法完全一致。结合PP 试管和PS 试管浸出液紫外光谱扫描结果可推断，反应过程中PP 试管和PS 试管有促进磷钼酸铵沉淀产生的物质渗出。为初步验证该推测，选用洗涤并浸泡不同时间的PS 和PP 试管重复配制标准曲线体系，结果显示，洗涤后的试管沉淀产生时间相比于未洗涤的试管得到增加，且沉淀产生时间与洗涤次数呈正相关；但经多次洗涤后，0 号管依然在30 min 内出现沉淀。该结果在一定程度上验证了上述推测，并说明该物质不是残留在PP 试管和PS 试管表面，而是从壁材中缓慢持续渗出，无法通过常规的洗涤操作除尽。

一次性塑料制品由于其良好的化学稳定性、成型性和加工性，被广泛应用于生命科学实验室，通常在塑料加工过程中可通过辐照灭菌技术灭菌和除酶，但生产过程中添加的塑料助剂（例如增塑剂、抗氧化剂、润滑剂、抗氧剂、阻燃抑烟剂等）存在溶出、渗出和迁移的情况，给科学实验带来无法预估的影响。G.Reid McDonald 等［4］发现冲洗过一次性塑料管的水、甲醇和二甲基亚砜均对人源单胺氧化酶有明显抑制作用，对溶出物进行质谱分析鉴定出一种抗菌剂和一种润滑剂。在塑料制品的生产中通常会使用多种添加剂，在不同温度和溶媒条件下溶出物的种类和量不同。据马立群等［5］的报导，磷系阻燃抑烟剂在常用塑料制品中应用广泛，包括无机系的磷酸铵盐、多磷酸盐和聚磷酸铵等，以及有机系的磷酸酯类，阻燃效果较佳，但易从聚烯烃壁材迁移。本研究中PP 试管和PS 试管组产生的大量黄色沉淀应是在硫酸、偏磷酸、草酸和乙酸存在的酸性条件下，塑料试管中的一种或多种磷系阻燃抑烟剂溶出所致。塑料试管中添加剂种类繁多，要确定其中对实验结果有影响的溶出组分，需采用元素分析仪、液相色谱、气相色谱联合质谱对溶出物进行全组分分析，所需设备昂贵，有待进一步研究。本研究表明，磷钼酸法测Vc 含量实验中不宜选用PP 和PS 试管作为反应容器，其中的溶出物易致反应体系产生沉淀；玻璃试管中反应体系能在水浴显色后维持至少1 h 的稳定，避免产生沉淀而影响比色结果，适用于该实验教学要求。