凋亡基因Caspase3和Caspase7单核苷酸多态性与胃癌遗传易感性研究

刘佳音 燕飞虎 张艳桥

胃癌是我国乃至世界最常见的危害人类生命健康的肿瘤之一。世界范围内，胃癌的发病率居第四位，其中超过70%的新发病例和死亡病例发生在发展中国家[1]。单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism，SNP)主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性，存在于整个基因组，是最常见的遗传变异，已成为第3代遗传标志[2]。SNP可能通过调节环境危险因素的影响来调节多个参与胃癌发生的生物学通路，本研究拟利用大样本研究Caspase 3与Caspase 7基因的SNP与胃癌遗传易感性的关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料

本研究纳入研究对象共2 036人，年龄范围为18～92岁，其中病例组1 000人，对照组1 036人。病例组来自2008—2011年哈尔滨医科大学遗传学教研室及2014年哈尔滨医科大学附属肿瘤医院招募的新诊断的、未接受任何治疗的、病理诊断明确的胃癌病人。对照组来自2010年哈医大附属肿瘤医院社区体检者、2014年3月—2014年12月哈尔滨医科大学附属第二医院、哈尔滨医科大学附属第一医院及黑龙江省祖国医药研究所的健康体检者及无癌患者。两组年龄和性别匹配，本研究已通过哈尔滨医科大学附属肿瘤医院伦理委员会审查合格并获得批准。

1.2 方法

所有受试者在招募前均签署知情同意书，并完成一份标准化问卷，内容包括人口统计信息、暴露信息(包括吸烟及饮酒状态)、工作经历、家族史，并捐献血样供分子流行病学检测。血液标本于2 mL离心管中，3 000 g，4℃，离心30 min。将离心好的血细胞和血清分别冻存于超低温冰箱中。使用DNA提取试剂盒提取全血细胞基因组DNA，具体操作步骤按试剂盒的使用说明进行。

1.3 SNP选择

本研究中的SNP位点是根据NCBI的dbSNP数据库(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/snp)和国际HapMap项目数据库(http：//hapmap.ncbi.nlm.nih.gov/)选择，包括Caspase 3与Caspase 7各两个SNP，这些是假定的4个miRNA靶位点(表1)。

表1 预测凋亡基因miRNA结合位点的SNP位点Table 1 The SNP sites of predicting miRNA binding sites for apoptotic genes

1.4 TaqMan探针基因分型筛选

采用ABI VIIA7实时荧光定量PCR仪对病例组及对照组DNA进行分型筛选，将已铺板的病例及对照DNA 2.25 μL用八通道排枪加入384孔板内，设置反应条件为5 μL体系，50个循环得到扩增曲线，扩增结束后用SDS2.0软件进行基因型分型筛选。红色和蓝色分别代表野生型和突变型两种纯合子等位基因型，中间绿色簇代表杂合子基因型，黑色叉代表阴性对照及分型失败(图1)。

图1 基因型鉴定结果示例Figure 1 The results of sample genotyping

1.5 统计学分析

利用SAS 9.1软件对数据进行统计分析，病例组与对照组之间性别、年龄、吸烟、饮酒状况的构成比的比较采用双侧χ2检验，对每个位点进行Hardy-Weinberg遗传平衡检验后，采用χ2检验比较病例组和对照组的单个位点基因型频率差异，再通过单因素和多因素Logistic回归模型分析基因型与疾病的关联，对每个位点分层分析不同性别、年龄、吸烟、饮酒状况亚层之间基因型与疾病的关联，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 基本情况差异

病例组和对照组年龄无统计学差异，病例组与对照组的吸烟、饮酒状态以及年吸烟包数构成存在统计学差异(P<0.05)(表2)。

表2 不同变量病例对照组间差异比较结果Table 2 Comparison of differences between case and control groups with different variables

2.2 Hardy-Weinberg遗传平衡定律分析

验证病例组和对照组两组人群基因频率是否符合哈代-温伯格平衡定律，病例组和对照组中Caspase3基因的2个位点基因型频率与Caspase7基因的2个位点基因型频率均符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律(P>0.05)，说明所选对照对于该基因具有人群代表性(表3)。

2.3 基因频率与基因型频率

本研究所选取4个位点的野生型等位基因分别为A、C、T、G，野生型纯合基因型为风险基因型，即rs1049253的AA、rs1049216的AA、rs4353229的CC和rs10787498的TT。

本研究所选取的4个符合哈代-温伯格平衡定律的位点病例组与对照组之间基因型频率都没有差异(表4)；Logistic回归结果显示4个位点都与疾病没有统计学关联。将带有风险等位基因的基因型组合后进行分析，显示出针对两个基因来说，带有两个风险基因型的个体比带有0～1个风险基因型的个体容易患病，其患病风险增加了69.6%；调整了协变量影响后带有3个风险基因型的个体比带有0～1个风险基因型的个体容易患病，其患病风险增加了27.6%；带有大于1个风险基因型的个体比带有0～1个风险基因型的个体容易患病，其患病风险增加了35%(表5)。

表3 哈代-温伯格平衡分析Table 3 Hardy-Weinberg balance analysis

表4 Caspase 3与Caspase 7等位基因频率分析Table 4 Caspase 3 and Caspase 7 allele genes frequencies

表5 基因型频率组间比较结果Table 5 Comparison of genotype frequencies between the case and control groups

2.4 分层分析

对每个位点以及风险基因型组合根据年龄、性别、吸烟、饮酒状况进行分层分析。本研究所选取的4个位点在任何亚层中都与疾病关；两个基因组合之后的分层分析中，年龄≤60岁、男性、从不吸烟、年吸烟包数≤25、胃非贲门腺癌的亚层中风险基因型与疾病有关(表6)。

表6 2个基因组合亚层之间比较结果Table 6 Results of comparison between sublayers of two gene combinations

3 讨论

细胞凋亡是细胞程序性死亡的一种模式，它通过清除受损的细胞起到保护作用，从而起到维持体内平衡的作用[3]。细胞凋亡途径的任何改变都可能导致各种疾病包括癌症的发生。Caspase对不同细胞死亡的刺激反应而活化，引起大量细胞蛋白水解，最终导致这种死亡形式产生了生物学及形态学上的变化[4]。Caspase3和Caspase7是哺乳动物细胞凋亡途径的执行者，它们在细胞凋亡的执行阶段及线粒体途径中发挥重要作用，如线粒体膜电位的去极化和促凋亡因子包括细胞色素C和凋亡诱导因子的释放[5]。

在此项基于医院的病例对照研究中，我们研究了位于Caspase3和Caspase7基因3′UTR常见的、假定有功能的一些SNP与东北地区人群胃癌发生风险的关系。其中2个位点位于Caspase3基因，分别是rs1049253和rs1049216；2个位点位于Caspase7基因，分别是rs4353229和rs10787498。我们的研究结果显示，将Caspase7的2个位点风险基因合并后进行多因素分析，带有1个风险基因型的个体比不带有风险基因型的患病风险增加。分层分析这种风险在年龄小于等于60岁，从不吸烟，年吸烟包数小于等于25包和非胃贲门腺癌人群中更为明显。将Caspase3和Caspase7基因的4个位点风险基因合并后进行多因素分析，带有2个风险基因型的个体比带有0～1个风险基因型的个体患病风险增加。然而，单因素分析这4个位点，并未发现其之间有统计学上的差异，亚层之间并无统计学关联。合并分析Caspase3的2个位点，也无统计学上的差异，分层分析2位点之间并无统计学关联。我们可以看出，Caspase7基因rs4353229和rs10787498位点的SNP是对胃癌风险贡献效果最为显著的联合位点。因此，这些研究结果表明，Caspase3两个位点与Caspase7两个位点SNP均与胃癌风险无关。将Caspase7基因两个位点的SNP合并分析表明其可能影响胃癌的易感性，或可作为疾病诊断和预后的生物学标志物。据我们所知，同时研究凋亡途径中效应Caspase3和Caspase7基因多个位点SNP与东北地区人群胃癌发病风险关系的文章此前鲜见。

Soung等[6]研究发现灭活Caspase7的基因突变可能导致其细胞凋亡功能缺失，从而诱发某些实体肿瘤的发生。一项动物实验研究表明，Caspase7缺乏的小鼠对内毒素(LPS)诱导的淋巴细胞凋亡有抵抗力，在LPS诱导的杀伤力作用下受到明显的保护[7]。根据Caspase7基因的生物学意义，Caspase7的遗传变异可能通过改变蛋白表达或其功能从而影响患癌症发生风险。许多研究发现在胃癌与结肠癌中Caspase7是下调的[8]。

在分层分析中，我们的数据表明所观察到的胃癌风险在年龄小于等于60岁，从不吸烟，年吸烟包数小于等于25包和非胃贲门腺癌人群中更为明显。由于年轻的患者暴露于吸烟和饮酒相对较少，同时我们在非吸烟者和非饮酒者中也观察到一些保护作用，他们可能只经历了一些轻微暴露因素。这与易感个体很可能是经历了一些轻微暴露因素的年轻者这一观点相符。相反地，老年人可能会暴露于更多的环境危害，从而丧失保护性等位基因的遗传优势[9]。然而，由于样本量有限，未来仍需要大样本研究进一步证实这种推断，在本研究中特别是分层分析中更应严谨处理。

越来越多的证据表明，结合靶基因mRNA的3′UTR的miRNA，通过调节原癌基因或抑癌基因的表达，在肿瘤发生中发挥重要作用[10]。位于miRNA靶mRNA结合位点的SNP可能影响miRNA与靶mRNA的相互作用，从而导致靶基因表达异常[11]。Garcia-Lozano等[12]发现Caspase7基因rs4353229的SNP可能与Caspase7的表达水平及类风湿性关节炎发病风险相关。然而，rs4353229基因型与胃癌风险之间的关系可能也与其他未知的结合位点附近功能性变异相关。在本研究中，我们并未对基因型mRNA的表达进行分析，因此在后续研究中，需要我们去进一步验证风险基因型mRNA的表达量，并对结合位点进行功能验证。

总体而言，本研究对凋亡途径中效应Caspase3和Caspase7基因多个位点的SNP与东北地区人群胃癌发病风险做了大样本的系统研究，但其中仍存在一些可能的限制。首先，这是一个基于医院的病例对照研究，可能存在选择偏倚，这是由于从癌症医院和综合医院招募的病例可能不能十分理想地代表所有地理上与相似的环境因素暴露下相匹配的人群病例。虽然我们将年龄、性别等暴露因素进行匹配，但吸烟情况、饮酒情况等无法进行精确的匹配，因此存在一定的差异。将病例和对照进行年龄、性别、居住区的频数进行匹配和进一步调整潜在的混杂因素后，运用Logistic回归分析进行校正，最终使得潜在的混杂偏倚最小化。每个SNP的基因型均分布符合哈迪-温伯格平衡，这进一步证实了我们控制选择的随机性。其次，幽门螺旋杆菌感染作为胃癌的主要危险因素之一，未在本研究中进行评估，这是因为医院并未进行这类常规检测，收集这些资料存在一定困难。与胃癌相关的一些因素如饮食习惯、职业暴露因素、心理精神情况也未能收集到，这在一定程度上降低了胃癌风险评估的可信性。幽门螺杆菌与Caspase3、Caspase7基因型联合作用需要更多的前瞻性研究和临床研究来进一步证实我们的发现。最后，由于癌症是一个复杂的多因素疾病，潜在的功能性多态性位点需要进行进一步的功能试验来预测整体风险。未来研究应包括更多参与凋亡通路基因的SNP，并结合每个SNP最合适的影响作用来提高其预测能力。因此需要来自国内外不同地域的大样本前瞻性研究来进一步证实并探索Caspase家族与胃癌发生风险的关系。