外周血白细胞PDE4C基因甲基化及环境因素交互作用与乳腺癌发病的关系

李 烁 张楠楠 李亮亮 龙志平 尹慧慧 赵亚双 王 帆

乳腺癌是常见的女性恶性肿瘤之一[1]。目前认为乳腺癌的发生是遗传因素和环境因素共同作用的结果，其中表观遗传学改变尤其是DNA甲基化的发生是乳腺癌发生发展的一个重要原因。除遗传因素外，DNA甲基化同时也会受环境因素的影响。有明确的证据表明膳食叶酸可以提供甲基，在调控DNA甲基化中起重要作用，从而与乳腺癌的发病相关[2]。作为磷酸二酯酶4(Phosphodiesterase 4，PDE4)家族的重要成员，PDE4C广泛分布于各种炎症细胞和免疫细胞，可作为抑制剂作用于细胞内靶点发挥抗炎作用[3]。Bao等研究发现在脑胶质瘤样本中PDE4C启动子发生高甲基化，伴随表达下调并与肿瘤进展相关，该研究得出结论，PDE4C能够促进细胞凋亡、抑制细胞迁徙而起到肿瘤抑制剂的作用[4]。

目前，尚没有研究报道PDE4C甲基化与乳腺癌发病的关系。因此，本研究旨在应用病例对照研究方法探讨外周血白细胞中PDE4C甲基化的状态及其与环境因素之间的联合、交互作用与乳腺癌发病风险之间的关系。

1 材料与方法

1.1 研究对象

采用病例对照的研究方法，患者为2010年10月—2014年12月在哈尔滨医科大学附属肿瘤医院乳腺外科首次就诊，经病理证实为乳腺癌并无其他癌症史的女性患者402例，所有患者术前均未接受化疗及其他抗癌治疗。对照为同时期纳入的哈尔滨医科大学附属第二医院的眼科住院患者和哈尔滨香坊社区的志愿者女性470例，对照人群中无乳腺癌疾病史以及其他癌症疾病史。采集病例及对照组的术前空腹静脉血5 mL，高速离心后及时分装、储存于-80℃备用。

1.2 流行病学调查

病例和对照使用统一的调查问卷进行流行病学调查。调查的主要内容包括人口学基本资料(年龄、身高、体重、BMI、民族、婚姻状况、文化程度、肿瘤家族史等)、发病前环境因素暴露信息，如：饮食习惯(蔬菜、蛋类、肉类、奶制品等食用量)、行为习惯(吸烟、饮酒、运动、体力活动、职业类型等)以及月经史、避孕药服用史等。

调查人员均为经过统一培训的哈尔滨医科大学公共卫生学院流行病学教研室的在读研究生，在调查过程中严格遵守调查员手册内容，采用面对面直接询问的方式完成问卷。数据由Epidata 3.1软件建立数据库，所有数据均进行二次录入，以防止数据的漏录和误录，然后将数据导出到Excel 2007中进行合并整理和分析。

1.3 实验室检测方法

1.3.1 DNA提取及重亚硫酸盐处理 本研究采用QIAamp DNA Blood Mini Kit，按照说明书对外周血进行白细胞DNA提取。使用Nanodrop 2000 Spectrophtomete检测DNA的质量和浓度。使用EpiTect重亚硫酸盐修饰试剂盒，按照说明书将提取到的DNA进行重亚硫酸盐处理，重亚硫酸盐转化的初始DNA总量为2 000 ng，转化后的DNA产量在50～100 ng/μL之间并保存在-80℃以备用。

1.3.2 质粒构建和标准曲线浓度稀释 使用TOPO TA Cloning for Sequencing试剂盒将目标区域新鲜纯化的特异性PCR产物用于质粒的构建，所有操作均按照说明书进行。提取的质粒DNA进行测序验证，并依据质粒长度进行计算。用于定量的质粒浓度按拷贝数107～10 /μL进行稀释，所选梯度分别为107、106、105、104、103、100、10，建立标准曲线进行定量。

1.3.3 PDE4C甲基化定量检测 使用ABI 7500 real-time PCR进行PCR扩增及DNA甲基化修饰的定量PCR特异性检测(qMSP)[5]。PDE4C基因扩增上下游引物：5′-CGGTTATTTATCGTTTGTAGGAGGAAACG-3′，5′-ATCCAACAACGCTTCTATTCGAATCCG-3′，MyOD基因(非甲基化基因)作为管家基因扩增的上下游引物序列：5′-CCAACTCCAAATCCCCTCTCTAT-3′，5′-TGATTAATTTAGATTGGGTTTAGAGAAGGA-3′。PCR反应体系：Universal SYBR Green Supermix试剂，10 μL；引物终浓度600 nmol/L，正反向引物各0.6 μL；重亚硫酸盐修饰后的DNA 5 ng，1 μL；补充双蒸水至20 μL。标准曲线样本、DNA样本及空白对照检测均采用副孔，以保证结果的稳定性和可重复性。基因甲基化检测PCR参数：(1)PDE4C：95℃ 6 min；95℃ 30 s，42个循环；66.5℃ 30 s；72℃ 30 s；(2)MyOD：95℃ 6 min；95℃ 30 s，42个循环；56℃ 30 s；72℃ 30 s。每个样本的甲基化水平计算：甲基化水平=(PDE4C基因甲基化拷贝数/MyOD基因拷贝数)×100%。

1.4 统计学分析

数据分析采用SPSS 24.0软件，采用χ2检验分析分类变量在病例组和对照组中的差异；采用t检验分析连续性变量在两组中的差异。采用单因素和多因素非条件Logistic回归分析PDE4C基因甲基化与乳腺癌发病风险之间的关系。基因和环境的联合和交互作用分别采用叉生分析、多因素Logistic回归分析，叉生分析的检验水准经Bonferroni进行多重检验校正，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 研究对象的基本人口学特征

本研究共纳入402例乳腺癌患者和470例对照。对病例组和对照组的基本情况进行分析(表1)。两组间婚姻状况、文化程度、工作性质和肿瘤家族史的差异具有统计学意义(P<0.05)，在后续的多因素分析时将这些因素纳入作为调整因素进行调整。

表1 乳腺癌病例组和对照组的基本特征[n(%)]Table 1 The characteristics of breast cancer patients and health controls[n(%)]

Note：a.Grouped by Asian standards；Missing values：marital status，3；education level，2；Occupation，112；family history of cancer，62；BMI，3.

2.2 PDE4C基因甲基化与乳腺癌发病的关系

调整了婚姻状况、文化程度、工作性质和肿瘤家族史的非条件logistic结果显示，PDE4C基因甲基化与乳腺癌的发病之间无统计学关联(P>0.05)(表2)。

表2 外周血白细胞PDE4C基因甲基化与乳腺癌发病风险的关系Table 2 Relationship between PDE4C gene methylation in peripheral blood leukocytes and the risk of breast cancer

2.3 环境因素与乳腺癌发病风险的分析

采用逐步回归的方法筛选与乳腺癌发病相关的环境因素，并将婚姻状况、文化程度、工作性质和肿瘤家族史作为调整因素。单因素和多因素Logistic回归结果如表3所示，将单因素分析中有统计学意义的环境因素纳入多因素Logistic回归模型中，结果显示，粗粮、蔬菜、葱属性植物、禽肉、牛奶、运动为乳腺癌的保护性因素。猪肉、心理应激指数、月经不规律为乳腺癌的危险因素。

表3 环境因素与乳腺癌发病风险的非条件logistic回归分析Table 3 Unconditional logistic regression analysis of environmental factors and risk of breast cancer

Note：a.Adjustment factors including Marital status，Education level，Occupation and Family history of cancer；b.Smoke，take at least one cigarette a day for more than 6 months；c.Alcohol，including all alcohol；d.Sports，including walking，climbing stairs，running，walking and various sports activities，etc.

2.4 PDE4C基因甲基化和环境因素的联合、交互作用与乳腺癌发病的关系

在多因素有意义的环境因素中，根据现有的研究报道，葱属性植物、运动、心理应激指数与炎症性疾病发生密切相关[6-9]。因此，本研究应用叉生分析及多因素logistic回归模型计算PDE4C甲基化与葱属性植物、运动、心理应激指数的联合和交互作用。结果显示，PDE4C高甲基化与葱属性植物(>3次/周)联合作用的OReg值为0.373(95%CI：0.208～0.668)，提示PDE4C高甲基化携带者增加葱属性植物的摄入量可降低乳腺癌的发病风险，但未发现PDE4C甲基化与葱属性植物之间有显著的交互作用。均未发现PDE4C甲基化与运动、心理应激指数之间存在显著的联合和交互作用(表4)。

表4 PDE4C甲基化和环境因素间联合和交互作用分析表Table 4 Combination and interactions between PDE4C methylation and environmental factors

Note：ORega，ORenvironment& gene methylation，combinations between gene and environmental factors，we analyzed the combined effects of three factors and PDE4C methylation，with thePvalue of 0.05/3 after Bonferroni correction；ORib，ORinteraction，interactions between gene and environmental factors；Adjustment factors including Marital status，Education level，Occupation and Family history of cancer.

3 讨论

乳腺癌的发生和发展是多因素、多步骤共同作用的复杂过程，如物理因素、化学因素以及基因突变和染色体异常等[7]。随着表观遗传学的发展，尤其是基因甲基化的深入研究，外周血白细胞作为癌症易感性的特异性DNA甲基化生物标志物的潜在用途已经被提出，这为乳腺癌复杂机制的解释和靶向治疗提供了依据。Choi等[8]应用病例对照的研究方法检测乳腺癌外周血白细胞的5-甲基胞嘧啶(5-mdC)的水平以研究外周血白细胞甲基化与乳腺癌的关系，该研究得出结论：外周血白细胞甲基化与乳腺癌的发生相关。在本研究中，对病例组和对照组的外周血白细胞进行甲基化检测，旨在探讨外周血白细胞PDE4C基因甲基化及其与环境因素交互作用和乳腺癌发病的关系。

世界癌症报告结果显示饮食习惯、体力活动、生活方式等均与癌症相关[9]。Hanf等[10]的在一项流行病学调查中指出减少红肉的摄入量会降低乳腺癌的发病风险，这与本项研究的结果一致，猪肉摄入量大于等于250克每周者比小于250克每周者的乳腺癌发病风险高，OR为1.915(95%CI：1.248～2.939)。牛奶中含有丰富的钙及结合亚麻油酸，世界癌症研究基金会报告中指出，高频次摄入牛奶会降低乳腺癌的发病风险[11]，本研究结果与其一致，调整后的OR为0.468(95%CI：0.240～0.913)。Hanf等[13]同时报道增加蔬菜、植物纤维的摄入量会降低乳腺癌的发病风险，本研究结果显示蔬菜(OR=0.428，95%CI：0.245～0.747)会降低乳腺癌的发病风险，与其报道结果一致。瑞典卡洛琳梅斯医学院的研究人员对6.1万名女性的健康状况进行长达17年的研究，根据问卷调查结果显示，约有300名乳腺癌患者喜欢吃大米等细粮，与喜吃粗粮者相比，她们患乳腺癌的风险高出44%，本研究结果显示粗粮摄入量大于等于50克每周会降低乳腺癌的发病风险，调整的OR为0.694(95%CI：0.500～0.965)。

由于近年来女性工作节奏加快，工作压力增大，月经不调和心理因素已经成为乳腺癌发生不可忽视的危险因素，本研究结果发现月经不规律比规律者的乳腺癌发病风险高，OR值为1.931(95%CI：1.080～3.455)；心理应激指数越高，乳腺癌的发病风险越高，应激指数>15分组的OR为2.415(95%CI：1.659～3.514)。研究报道运动可以明显预防乳腺癌的发生，机体可以通过运动燃烧脂肪来调节月经周期，增强和改善心肺功能，使心情愉悦，从而精神状态放松，缓解心理压力，降低乳腺癌的发病风险[12]，本研究中运动调整后的OR为0.519(95%CI：0.368～0.732)，与报道的结论相同。

慢性炎症是肿瘤发生和发展的危险因素。PDE4C作为抑制剂的抗炎机制主要包括诱导具有抑制细胞活性的细胞因子的生成(如白细胞介素-2)和抑制多种炎症介质的活性等，PDE4C发生甲基化时，表达降低，失去抗炎抑制剂的作用，上述抗炎机制失活，导致慢性炎症，继而诱导肿瘤的发生。已有研究报道，某些刺激性食物如葱属性植物具有抗炎、抗氧化的作用，对肿瘤的发生起保护作用[13]。一项研究表明[14]，葱属性植物中的烯丙基硫化合物可以改变肿瘤的微环境和癌前细胞的生物学行为，降低癌症的发生风险。本研究中我们发现葱属性植物的摄入量大于3次每周会降低乳腺癌的发病风险(OR=0.365，95%CI：0.254～0.523)；在联合、交互作用分析中，结果显示PDE4C基因的高甲基化与葱属性植物(>3次/周)的联合作用的OR值为0.373(95%CI：0.208～0.668)，此结果提示PDE4C基因高甲基化携带者增加葱属性植物的摄入量，可降低乳腺癌的发病风险。

本研究局限性为环境因素资料的收集存在一定的回忆偏倚。问卷中关于饮食因素的资料是以频次划分，对暴露的剂量分析不够细致，无法给出定量的分析结果。由于样本量的限制，在叉生分析时亚组分析的统计学检验效能不足，结果有待大样本人群研究验证。本研究是回顾性病例对照研究，血液样本在病人确诊为乳腺癌之后收集，因此需要基于队列人群的前瞻性研究进一步验证。

综上所述，本研究结果表明乳腺癌的发生是多方面因素共同作用的结果。PDE4C基因高甲基化不是乳腺癌发病的独立危险因素。心理应激指数偏高、月经周期不规律和长时间较高频次/摄入量的猪肉，会增加乳腺癌的发病风险。较高频次/摄入量的粗粮、蔬菜、葱属性植物、禽肉、牛奶，经常锻炼身体会降低乳腺癌的发病风险。PDE4C高甲基化携带者增加葱属性植物的摄入量可降低乳腺癌的发病风险。