核受体Nur77对肝癌细胞迁移和侵袭的影响

古诚鑫?王坤元?余柑祥?王芝蕾?甘静娣?卢倩廷?杨涛?杨辉

【摘要】目的 探讨核受体Nur77对人肝癌细胞迁移和侵袭能力的影响。方法 采用蛋白免疫印迹法检测人正常肝细胞L02及肝癌细胞株SMMC-7721、Bel-7402、Hep3B、SK-Hep1和HepG2的Nur77蛋白基础表达水平。根据不同细胞株Nur77蛋白的表达情况，采用蛋白免疫印迹法分别验证应用siRNA沉默SMMC-7721和Hep3B细胞及过表达质粒转染HepG2细胞48 h后Nur77蛋白表达水平。并利用Transwell小室探讨沉默或过表达Nur77对肝癌细胞迁移、侵袭的影响。结果 蛋白免疫印迹结果显示与其他肝癌细胞株相比，Nur77蛋白在正常人肝细胞中表达稍低，在SMMC-7721和Hep3B高表達，而在HepG2细胞中的表达最低。因此，我们用Nur77 siRNA处理SMMC-7721和Hep3B细胞并与未处理组（siGFP对照组）进行比较，Nur77过表达质粒转染HepG2细胞。Transwell小室结果显示与siGFP对照组相比，Nur77 siRNA处理组在SMMC-7721和Hep3B两种细胞中的迁移和侵袭数目均减少（P均< 0.05）。与pENTER空载质粒对照组相比，Nur77过表达组HepG2细胞的迁移和侵袭数目显著增多（P均< 0.05）。结论 Nur77可能通过促进肝癌细胞的迁移和侵袭从而介导肝癌的进展。

【关键词】肝细胞癌;细胞核受体Nur77;迁移;侵袭

Effect of nuclear receptor Nur77 on migration and invasion of hepatocellular carcinoma cells Gu Chengxin， Wang Kunyuan， Yu Ganxiang， Wang Zhilei， Gan Jingdi， Lu Qianting， Yang Tao， Yang Hui. Depar-tment of Gastroenterology， the Second Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University， Guangzhou 510260， China

Corresponding author， Yang Tao， E-mail： ytabc2007@ 163. com

【Abstract】Objective To evaluate the effect of nuclear receptor Nur77 on the migration and invasion of human hepatocellular carcinoma cells.  Methods The basic expression levels of Nur77 protein in normal human liver cell line L02 and liver cancer cell lines SMMC-7721， Bel-7402， Hep3B， SK-Hep1 and HepG2 were detected by Western blot. According to the expression of Nur77 protein in different cell lines， the expression of Nur77 protein was detected by Western blot after silencing Nur77 in SMMC-7721 and Hep3B cells and overexpressing Nur77 in HepG2 cells for 48 h. Meanwhile， the effect of silencing or overexpressing Nur77 upon the migration and invasion of the hepatocellular carcinoma cells was evaluated by using Transwell chamber.  Results Western blot demonstrated that Nur77 protein was slightly expressed in normal human hepatocytes compared with those in other hepatocellular carcinoma cell lines. Nur77 protein was highly expressed in SMMC-7721 and Hep3B cells， whereas the least expressed in HepG2 cells. Therefore， we treated SMMC-7721 and Hep3B cells with Nur77 siRNA and compared them to the untreated group （siGFP control group）， and the Nur77-overexpression plasmid was transfected into HepG2 cells. Compared with the siGFP control group， the number of migration and invasion of both SMMC-7721 and Hep3B cells was significantly decreased in the Nur77 siRNA group（all P < 0.05）. Compared with the pENTER empty plasmid control group， the quantity of migration and invasion of HepG2 cells was significantly increased in the Nur77-overexpression group（both P < 0.05）.  Conclusion Nur77 mediates the progression of liver cancer probably by promoting the migration and invasion of hepatocellular carcinoma cells.

【Key words】Hepatocellular carcinoma;Nuclear receptor Nur77;Migration;Invasion

肝癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，发病率居全球第五位，而死亡率则为第三位[1-2]。肝癌细胞的迁移和侵袭能力是导致肝癌多发转移和不良预后的重要因素，对参与肝癌迁移和侵袭的靶向分子的研究是治疗肝癌的重要方向。有研究表明，Nur77（又称神经生长因子诱导的基因B）参与很多生物学调控的过程，包括炎症、代谢和凋亡等多方面，并且对肿瘤细胞的增殖和血管形成均有重要的作用[3-4]。此外，与正常组织相比，Nur77在包括结肠癌、卵巢癌、肺癌、膀胱癌等多种肿瘤组织中高表达，并且与肿瘤分级、远处转移风险、整体患者存活率密切相关[5-6]。在结肠癌的研究中可以发现，Nur77可以通过调节结肠癌细胞的上皮间质化（EMT）促进结肠癌细胞的侵袭转移。同样，也有研究表明，人肝癌组织Nur77的高表达与肿瘤的分化程度、门静脉血栓形成、转移和复发密切相关[7]。然而，Bian等[8]研究却发现Nur77可以通过拮抗PEPCK1的降解来介入糖代谢的途径而抑制肝癌的进展。因此，Nur77在肝癌中的作用仍存在争议，而Nur77对肝癌细胞的迁移和侵袭的影响也不明确。本研究通过基因沉默和高表达Nur77后探究肝癌细胞迁移和侵袭能力的改变情况，明确Nur77在肝癌细胞迁移和侵袭中的作用。

材料与方法

一、材 料

试剂及耗材DMEM培养基、胰酶和胎牛血清购自美国Gibco公司。阴性对照siGFP购自美国CST公司，人特异性Nur77 siRNA购自苏州吉玛公司。人特异Nur77 pENTER及其对照购自山东维真生物科技公司。迁移、侵袭小室购自美国康宁公司。PVDF膜购自美国西格玛公司。

二、细胞培养和处理

细胞L02和SMMC-7721来源于上海中国科学院细胞库，Bel-7402、Hep3B、SK-Hep1、HepG2来源于美国ATCC细胞库。人肝癌细胞置于37℃，含5%CO2的培养箱中，加入含10%胎牛血清及青霉素（100 Unit/ml）和链霉素（1 μg/ml）的DMEM培养基培养。细胞处理时，人肝癌细胞均匀铺在6孔板内，利用LipofectamineTM RNAiMAX转染siRNA，或者利用LipofectamineTM 3000转染pTENTER高表达及对照质粒。48 h收获细胞并通过蛋白免疫印迹法验证蛋白中Nur77的表达量。

三、蛋白免疫印迹法

当肝癌细胞（Hep3B、SMMC-7721、HepG2）分别转染siRNA或质粒48 h后，分别将正常培养一定时间及转染的对照组（siGFP组）、实验组（Nur77 siRNA组）细胞用RIPA裂解液于冰上提取細胞中的总蛋白，BCA浓度梯度定量法测定并调整样本至相同蛋白浓度。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳，转移蛋白至PVDF膜上，用5%脱脂奶粉室温封闭1 h，TBST洗脱后加入对应一抗稀释液于4℃低温摇床上孵育过夜。次日TBST洗涤PVDF膜3次，每次5 min，加入适宜浓度脱脂奶粉配制的对应种属二抗常温低速摇床孵育2 h。洗涤PVDF膜后滴加HRP化学发光液避光孵育5 min，用X线片于曝光机显影并定影。

四、细胞迁移和侵袭实验

人肝癌细胞均匀铺于6孔板后，分别转染siRNA或Nur77高表达质粒，作用48 h后，使用胰酶消化细胞并计数细胞，约5×105/小室。等量的细胞加入提前准备好的Transwell小室的上室中，约100 ～ 200 微升/小室，下室中加入800 ml含10%胎牛血清的正常细胞培养基。细胞培养箱孵育7 ～ 8 h，观察并用结晶紫染色迁移下室膜中的细胞数目，于400倍放大白光显微镜摄像后计数统计。侵袭小室的孵育时间约延长1倍（16 h）后同样方法观察下室膜中细胞数目情况。

五、统计学处理

采用SPSS 17.0进行数据分析。正态分布资料以表示，组间比较采用t检验;非正态分布资料以中位数（下四分位数，上四分位数）表示，组间比较采用秩和检验。P < 0.05为差异有统计学意义。

结果

一、正常肝细胞及不同肝癌细胞株的Nur77蛋白表达水平

蛋白免疫印迹法结果显示，在5种肝癌细胞株中，Hep3B和SMMC-7721的Nur77蛋白基础表达水平最高，而HepG2的表达最低（图1）。因此选用Hep3B和SMMC-7721两个细胞株进行siRNA干扰实验，选用HepG2细胞株进行质粒高表达实验。此外，可检测到正常肝细胞L02的Nur77蛋白水平表达，提示Nur77并不是肿瘤的特异性表达蛋白。

二、肝癌细胞株Nur77 siRNA干扰及Nur77质粒高表达后蛋白表达水平

在Hep3B和SMMC-7721细胞中均发现，与siGFP组相比，Nur77 siRNA组的Nur77蛋白水平降低（图2），提示siRNA干扰实验的作用明显。此外，在HepG2细胞中，与pENTER空白对照组相比，pENTER-Nur77组的Nur77蛋白表达水平上升（图2），这也提示pENTER-Nur77的高表达质粒作用显著。

三、Nur77 siRNA抑制Hep3B和SMMC-7721细胞株的迁移及侵袭

Transwell小室细胞实验结果显示，在阴性对照siGFP和Nur77 siRNA转染Hep3B细胞48 h后，与siGFP对照组相比，相同数目的Nur77 siRNA组

transwell小室中培养8 h后下室中的细胞数目减少[10.0（4.5，18.0）vs. 4.0（2.2，6.0），Z = -3.89，P < 0.01]，见图3A。提示Nur77 siRNA能显著抑制肝癌细胞Hep3B的迁移。侵袭实验结果发现，与siGFP对照组相比，转染48 h后相同细胞数目的Nur77 siRNA组transwell小室中培养16 h

后下室中的细胞数目减少[10.0（9.0，14.0）vs. 5.0（4.0，6.0），Z = -6.57，P < 0.01]，见图3A。提示Nur77 siRNA对肝癌细胞Hep3B的侵袭也具有明显的抑制作用。

此外，在SMMC-7721细胞中进行迁移和侵袭实验，结果发现转染48 h后，相同细胞数目的Nur77 siRNA组transwell小室培养一定时间后的下室细胞数目均较siGFP组减少[97.0（93.5，100.0）vs. 49.0（44.5，55.2），Z = -5.84;42.5（32.0，50.8） vs. 14.0 （12.0，17.0），Z = -4.73，P均< 0.05]，见图3B。提示Nur77 siRNA抑制SMMC-7721细胞的迁移和侵袭能力。

四、Nur77 高表达促进HepG2细胞的迁移和侵袭

利用transwell小室检测肝癌细胞HepG2的功能，结果发现，与pENTER空载质粒对照组比较，相同细胞数目的Nur77高表达组在迁移小室培养

8 h后下室细胞数目增多[（18.0±3.3）vs. （21.1± 6.8），t = -2.33，P < 0.05]，见图4。结果提示Nur77 高表达促进HepG2细胞的迁移。同时，相同细胞数目和组别的HepG2细胞在含基质胶的transwell小室中培养16 h后，Nur77 高表达组细胞数目增多[4.0（3.0，5.0） vs. 6.0（5.0，8.8），Z = -3.30，P < 0.05]，见图4。结果提示Nur77高表达促进HepG2细胞的侵袭。

讨论

迁移和侵袭是恶性肿瘤的重要生物学特征，是涉及多种因素的生物学行为。而肿瘤的迁移和侵袭能力与患者的预后密切相关，也是衡量疾病进展的重要指标[9-10]。本研究发现，Nur77在肝癌细胞的迁移和侵袭中发挥了重要作用。在明确不同肝癌细胞株的Nur77蛋白表达水平并不相同后，通过敲低高Nur77本底表达量的SMMC-7721和Hep3B两种细胞株，发现Nur77 siRNA组与对照组相比，肝癌细胞的迁移和侵袭得到显著抑制。相反的，高表达Nur77后的HepG2细胞迁移和侵袭则显著增强。

目前，Nur77在肝癌中的作用仍有争议，它对于肝癌细胞增殖、迁移和侵袭的作用并不明确，且于不同肿瘤间发挥着促癌或抑癌的作用。有研究发现，Nur77在包括胃癌、大肠癌和前列腺癌等多种肿瘤中高表达，并且能通过加速细胞周期进程， 增加S/G2期的细胞数目等方式发挥促癌作用[11]。更为重要的是，Nur77在血管形成中同样发挥着关键的作用。Zeng等研究（2006年）发现，血管内皮生长因子（VEGF）-A可以通過激活Nur77的转录调控作用促进血管的生成。尽管在未成熟胸腺瘤细胞或T细胞杂交瘤中，Nur77分子能通过促进细胞凋亡而发挥抑癌的作用，但Nur77在多种肿瘤中均证实发挥着促癌的作用并且与患者的预后密切相关[12]。此外，Nur77还具有促进肿瘤细胞迁移的作用。Wang等[13]研究发现，在临床的结直肠癌组织中可以检测到Nur77蛋白的高表达，而Nur77的高表达与晚期肿瘤、淋巴结、远处转移阶段、淋巴结转移和存活率差均有显著的相关性。体内外研究也发现，在基因沉默Nur77蛋白后细胞迁移和侵袭能力均下降，而高表达Nur77则出现相反的结果。本研究也发现，在SMMC-7721和Hep3B这两种肝癌细胞中，基因沉默Nur77蛋白的表达显著抑制肝癌细胞的迁移、侵袭。而高表达Nur77则可以观察到迁移和侵袭的显著增强。这与在结肠癌中的研究情况类似，也表明肝癌细胞中Nur77的表达可能与肝癌的淋巴结转移和存活率密切相关。

有研究表明，在结肠癌细胞中，组织缺氧会刺激Nur77和β-catenin分子的共表达，并形成相互反馈的循环回路[14]。这种循环回路也诱导癌细胞穿过基质膜屏障，诱导癌细胞入侵。当过表达Nur77或β-catenin时均能导致上皮细胞的标记蛋白E-cadherin表达量的下降，以及间皮细胞标记蛋白N-cadherin和基质金属蛋白质酶（MMP）-2的上调，进而促进EMT，强化肿瘤细胞的迁移和侵袭能力。另外，Wang等[13]研究发现，Nur77可以通过直接与MMP-9启动子结合，激活MMP-9的转录，激活癌细胞的转移，促使肿瘤的进展和恶化。

Nur77是孤核受体家族中通过与相应调节因子发挥作用，调控基因表达和转录从而参与肿瘤迁移和侵袭的蛋白受体。它可以通过调节肿瘤细胞周期或促进VEGF合成促进肿瘤的增殖，也可以通过改变BCL-2的表型并靶向转移作用于线粒体发挥促细胞凋亡的作用[15]。在结肠癌细胞中，Nur77通过可调节β-catenin或EMT从而促进肿瘤的迁移和侵袭。我们的研究发现，在肝癌细胞中，Nur77同样可以发挥促进肿瘤迁移和侵袭的特性，但是否类似的通过β-catenin或EMT来发挥作用仍需进一步研究。本课题拟通过探讨Nur77在肝癌迁移和侵袭的作用，为肝癌发病机制研究提供新的方向，为肝癌治疗潜在靶点提供一定的理论基础。

参 考 文 献

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（收稿日期：2019-06-18）

（本文編辑：杨江瑜）