MicroRNA-126在动脉粥样硬化性脑梗死患者血清中的表达变化及其机制研究

张翠，司君增，郑立峰

（莱芜市人民医院 神经内科，山东 莱芜 271100）

脑梗死又称缺血性脑卒中，其发病率逐年升高，动脉粥样硬化尤其是颈动脉粥样硬化（Atherosclerosis，AS）是脑梗死的主要病因和危险因素[1]。MicroRNA（miRNA）在动脉粥样硬化性脑梗死（atherosclerosis cerebral infarction，ACI）调控中发挥着重要作用[2]。研究显示，MicroRNA-126（miR-126）在ApoE（-/-）小鼠颈动脉粥样硬化斑块中表达降低，推测其可能参与AS的形成过程[3]，但作用机制尚不清楚。本研究旨在观察miR-126在ACI患者血清中的表达变化及其对血管平滑肌细胞增殖和迁移的影响，并探讨其可能的调控机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2015年11月—2017年11月莱芜市人民医院发病7 d内就诊的150例急性脑梗死患者。纳入标准：①符合第四届全国脑血管病会议修订的诊断标准[4]，经颅脑CT或MRI证实；②第1次发生急性脑梗死；③患者知情同意。排除标准：①既往有脑血管史；②合并有心、肝及肾功能不全和肿瘤、自身免疫性疾病等；③入院前6个月有服用降脂药物史。150例急性脑梗死患者依据新TOAST卒中分类标准，分为ACI组110例和非动脉粥样硬化性脑梗死（non atherosclerosis cerebral infarction，NACI）组患者40例。ACI组：男性60例，女性50例；年龄（66.47±7.99）岁。ACI组患者又根据颈动脉彩色多普勒超声结果分为稳定斑块患者74例和不稳定斑块患者36例。NACI组：男性23例，女性17例；年龄（65.99±8.24）岁。同时选择同期40例年龄、性别相匹配的健康志愿者作为对照组，对照组行彩色多普勒超声检查排除AS。对照组：男性22例，女性18例；年龄（66.11±7.14）岁。所有受试者采集空腹外周静脉血10 ml，3 000 r/min离心10 min分离血清，-80℃保存待检。3组性别、年龄、舒张压（DBP）、空腹血糖（FPG）及高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）等一般资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05），而收缩压（SBP）、总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）及低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。本研究通过医院伦理委员会批准，患者签署知情同意书。见表1。

1.2 主要试剂和细胞系

血清miRNA提取试剂盒（美国Ambion公司），miR-126模拟物、模拟物阴性对照、miR-126抑制物及抑制物阴性对照均购自广州锐博生物公司，Trizol试剂及LipofectamineTM2000购自美国Invitrogen公司，RNA逆转录试剂盒、实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）试剂盒购自大连宝生生物工程公司，miR-126、U6引物购自上海吉玛制药公司，CCK-8试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司），Transwell小室（美国Corning公司），一抗基质金属蛋白酶13（matrix metalloprotein，MMP-13）和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）及二抗均购自美国Santa Cruz公司。人血管平滑肌细胞系HA-VSMC（美国ATCC细胞库）。在DMEM培养基中培养，置于37℃、5%二氧化碳CO2的饱和湿度恒温箱培养箱中常规传代培养，取生长状态良好的对数生长期细胞进行后续实验。

表1 3组患者一般资料比较

续表1

1.3 方法

1.3.1 qRT-PCR应用Trizol试剂提取细胞总RNA，用miRNA提取试剂盒提取血清中的miRNA，鉴定纯度和含量后，参照逆转录试剂盒说明书操作，采用miR-126特异性逆转录引物合成cDNA。以cDNA为模板，按照qRT-PCR试剂盒说明书配置反应体系进行PCR反应。miR-126引物序列，正向引物：5＇-GGCTTCGTACCGTGAGTAAT-3＇，反向引物：5＇-GTGCAGGGTCCGAGGT-3＇。PCR反应条件：95℃预 变性30 s，95℃变性5 s，60℃退火20 s，72℃延伸1 min，共40个循环。以U6作为内参基因，采用2-△△Ct法计算miR-126相对表达水平。

1.3.2 细胞转染取对数生长期HA-VSMC细胞，接种于6孔细胞板，常规培养24 h，待细胞增长至50%～60%密度时，即可进行细胞转染。采用LipofectamineTM2000说明书操作，分别将miR-126模拟物、模拟物阴性对照、miR-126抑制物及抑制物阴性对照转染至HA-VSMC细胞，转染后HA-VSMC细胞分为miR-126模拟物组、模拟物阴性对照组、miR-126抑制物组及抑制物阴性对照组。转染后24 h，采用qRT-PCR检测各组细胞miR-126的表达水平，评估转染效率。

1.3.3 CCK-8法收集转染后48 h的4组HAVSMC细胞，以5 000个/孔的密度接种于96孔细胞板，每组设5个复孔，参照CCK-8试剂盒说明书在避光条件下加入10μl CCK-8反应液后，置入细胞孵育箱中37℃继续孵育4 h后，在酶标仪上设定波长450 nm，检测各孔的光密度（optical density，OD）值，以OD值表示细胞的增殖活性。

1.3.4 Transwell迁移实验收集转染后48 h的各组HA-VSMC细胞，以无血清培养基重悬制备单细胞悬液，取0.1 ml单细胞悬液（含1×105个细胞）加入Transwell小室的上室，下室加入0.5 ml含10%胎牛血清的DMEM培养基，放入细胞孵育箱中继续孵育24 h后取出小室，棉签轻轻擦弃小室上室的细胞，小室膜上的细胞以95%乙醇溶液固定，染色后显微镜下观察，并随机取10个高倍视野计算迁移细胞数，以穿膜细胞数表示细胞的迁移能力。

1.3.5 Western blotting收集转染后48 h的4组HA-VSMC细胞，加入细胞裂解液和蛋白酶/磷酸酶抑制剂提取细胞总蛋白质，BCA法定量蛋白质浓度。取200μl样品上样，聚丙烯酰胺凝胶电泳电泳分离，将电泳产物转聚偏二氟乙烯膜，室温条件下脱脂奶粉封闭2 h后，缓冲液漂洗3遍，分别加入一抗MMP-13和GAPDH，4℃过夜，缓冲液漂洗3遍，加入相应的二抗，室温孵育1 h，洗膜后ECL显影液显影，采集图片，Image Lab软件分析条带灰度。

1.4 统计学方法

数据分析采用SPSS 21.0统计软件。计量资料以均数±标准差（x±s）表示，比较用t检验或方差分析，进一步的两两比较用SNK-q检验；计数资料以构成比表示，比较用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3组血清中miR-126表达比较

qRT-PCR结果显示，对照组、ACI组和NACI组血清中miR-126的表达水平分别为（1.01±0.04）、（0.97±0.08）和（0.60±0.14），3组血清中miR-126表达比较，差异有统计学意义（F=270.240，P=0.000）；ACI组血清中miR-126的表达水平低于NACI组和对照组（P＜0.05），NACI组和对照组血清中miR-126表达比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见图1。

图1 3组血清miR-126表达水平比较 （±s）

ACI组中不稳定斑块和稳定斑块患者血清中miR-126表达水平分别为（0.42±0.08）和（0.69±0.17）。ACI组中不稳定斑块患者血清中miR-126表达水平低于稳定斑块患者（t=9.039，P=0.000）。见图2。

2.2 各组HA-VSMC细胞miR-126表达水平比较

qRT-PCR结果显示，miR-126模拟物组、模拟物阴性对照组、miR-126抑制物组和抑制物阴性对照组miR-126表达水平分别为（7.10±0.30）、（1.02±0.04）、（0.35±0.10）和（1.00±0.05）。4组miR-126表达水平比较，差异有统计学意义（F=1158.600，P=0.000）；miR-126模拟物组miR-126表达水平高于模拟物阴性对照组（P＜0.05），miR-126抑制物组miR-126的表达水平低于抑制物阴性对照组（P＜0.05），说明转染效率较高。见图3。

图3 各组miR-126表达水平比较 （±s）

2.3 各组HA-VSMC 细胞增殖活性比较

CCK-8法结果显示，miR-126模拟物组、模拟物阴性对照组、miR-126抑制物组和抑制物阴性对照组细胞OD值分别为（1.45±0.12）、（2.10±0.10）、（2.62±0.18）和（2.05±0.13）。4组OD值比较，差异有统计学意义（F=37.300，P=0.000）；miR-126模拟物组细胞的OD值低于模拟物阴性对照组（P＜0.05），miR-126抑制物组细胞的OD值高于抑制物阴性对照组（P＜0.05）。说明上调HA-VSMC细胞miR-126表达能抑制细胞增殖活性，而下调HAVSMC细胞miR-126表达却能增强细胞增殖活性。见图4。

2.4 各组HA-VSMC细胞的迁移能力比较

Transwell迁移实验结果显示，miR-126模拟物组、模拟物阴性对照组、miR-126抑制物组和抑制物阴性对照组迁移细胞数分别为（19.20±5.00）、（28.10±3.00）、（28.00±5.00）和（40.50±6.00）个。4组迁移细胞数比较，差异有统计学意义（F=9.690，P=0.005）；miR-126模拟物组迁移细胞数低于模拟物阴性对照组（P＜0.05），miR-126抑制物组迁移细胞数低于抑制物阴性对照组（P＜0.05）。说明上调HAVSMC细胞miR-126表达能抑制细胞迁移能力，而下调HA-VSMC细胞miR-126表达却能提高细胞迁移能力。见图5、6。

图4 4组细胞增殖活性比较 （±s）

2.5 miR-126靶基因的预测

查阅TargetScan（http：//www.targetscan.org）和miRanda（www.microrna.org）生物信息学数据库发现，miR-126与MMP-13的3’UTR区存在种子序列互补的结合位点。结合相关文献[5]，推测MMP-13可能是miR-126的作用靶基因。见图7。

图5 各组细胞迁移能力 （×200）

图6 各组细胞迁移能力比较 （±s）

2.6 各组HA-VSMC细胞MMP-13蛋白表达比较

Western blotting结果显示，miR-126模拟物组、模拟物阴性对照组、miR-126抑制物组和抑制物阴性对照组MMP-13蛋白表达水平分别为（0.32±0.13）、（0.95±0.15）、（1.69±0.23）、（0.88±0.19）μg/L。4组MMP-13蛋白表达水平比较，差异有统计学意义（F=29.560，P=0.000）；miR-126模拟物组MMP-13蛋白表达水平低于模拟物阴性对照组（P＜0.05），miR-126抑制物组MMP-13蛋白表达水平高于抑制物阴性对照组（P＜0.05）。说明上调HA-VSMC细胞miR-126表达能抑制细胞MMP-13蛋白表达，而下调HA-VSMC细胞miR-126表达却能提高细胞MMP-13蛋白表达。见图8。

图7 miR-126和MMP-13的3’UTR区结合序列

图8 4组MMP-13蛋白的表达

3 讨论

AS是多种缺血性心脑血管疾病的基础，血管内皮细胞损伤和炎症激活、平滑肌细胞增殖和迁移、单核巨噬细胞活化释放炎症介质是AS发生、发展的重要过程，也是ACI发生的病理基础[6]。目前研究证实，血管平滑肌的异常增殖及迁移在促进AS及ACI的发生、发展中发挥着重要的作用[7]。

近年来研究显示，miRNA在转录后水平调控靶基因的表达，广泛参与AS发病机制的多个环节[2]。miR-126是近年来发现与肿瘤、炎症反应及细胞增殖分化等密切相关miRNA家族成员之一，其编码基因定位于染色体9q34.3，表皮生长因子样结构域1基因的第7个内含子中[8-9]。miR-126与AS的关系引起学者关注。WANG等[10]研究中发现，miR-126在冠状动脉粥样硬化性心脏病患者血清中表达水平降低，且在不稳定型心绞痛和急性心肌梗死患者血清中表达水平更低，推测miR-126与AS有关。王婷等[3]研究中发现，miR-126在ApoE（-/-）小鼠颈AS斑块中的表达降低，认为miR-126参与颈AS的形成和发展过程。但目前有关miR-126在ACI患者血清中表达情况及作用机制的研究尚未见报道。本研究中，笔者通过qRT-PCR检测发现，ACI患者血清中miR-126的表达水平低于NACI患者和对照组，而NACI患者和健康对照组比较无差异；进一步统计分析发现，ACI组中不稳定斑块患者血清中miR-126的表达水平低于稳定斑块患者，提示miR-126在ACI的发生、发展中发挥着重要的作用。

研究发现，血管平滑肌细胞的异常增殖和迁移在AS的发生、发展中发挥着重要的作用[7]。miRNA能通过调控血管平滑肌细胞的增殖、凋亡及迁移参与AS的发生、发展。李晓丽等[11]研究发现，miR-181b在颈AS患者血清中表达降低，其可能通过抑制血管平滑肌细胞的增殖和迁移起到抗AS的作用。XIE等[12]报道，上调血管平滑肌细胞中miR-599的表达能抑制血管平滑肌细胞的增殖和迁移能力，从而干预AS的进展。为研究miR-126是否也能通过影响血管平滑肌细胞增殖和迁移参与ACI的发生、发展，笔者通过脂质体转染法将miR-126模拟物和抑制物分别转染入人血管平滑肌细胞HA-VSMC中，上调或下调细胞中miR-126的表达水平。CCK-8实验和Transwell实验显示，上调HA-VSMC细胞中miR-126水平能抑制细胞的增殖和迁移能力，而下调miR-126水平却能提高细胞的增殖和迁移能力。证实miR-126能通过抑制血管平滑肌细胞的增殖和迁移能力，起到抗AS的作用。

miR-126抑制血管平滑肌细胞的增殖和迁移能力的下游通路尚不明确。笔者通过生物学信息网站预测MMP-13可能是miR-126的作用靶基因，近期WU等[5]在研究中也发现，miR-126通过靶向调控MMP-13，从而调控骨巨细胞瘤的分化。MMP-13是基质金属蛋白酶家族重要成员之一。研究证实，MMP-13与血管平滑肌细胞的增殖、凋亡、迁移、血管收缩及血栓形成等AS病变过程有关[13]。抑制MMP-13能减少胶原在颈动脉斑块中的聚集，甚至增加已形成的斑块的稳定性[14]。为研究miR-126在血管平滑肌细胞中能否也可通过调控MMP-13影响细胞的增殖和迁移能力。笔者通过Western blotting检测发现，上调HA-VSMC细胞中miR-126水平能下调细胞中MMP-13表达水平，而下调miR-126水平却能升高细胞中MMP-13表达水平，提示miR-126可能通过调控MMP-13表达调控血管平滑肌细胞的增殖和迁移。

综上所述，miR-126在ACI患者血清中表达降低，miR-126能通过抑制血管平滑肌细胞的增殖和迁移，起到抗AS的作用，其机制可能与下调MMP-13的表达有关。