PTPRS在食管腺癌中的表达水平及临床意义*

张国亮，朱奇坤，曾辉，王涛，高峰，王瑞

（河北医科大学第四医院 胸外科，河北 石家庄 050011）

食管癌是危及人类健康的恶性肿瘤[1]，具有早期转移、侵袭、浸润等特点。因此，研究食管癌侵袭、转移的基因，能为精准治疗提供理论依据。PTPRS是抑制基因，与肝癌、肺腺癌的预后相关[2-3]，但关于PTPRS在食管腺癌的表达，国内外相关报道较少。本研究采用组织芯片和免疫组织化学法对71例配对的食管黏膜组织、癌组织及癌旁组织中PTPRS蛋白的表达水平进行检测，探讨其与食管腺癌患者临床病理特征和预后的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2010年2月—2016年5月河北医科大学第四医院行根治性切除的71例食管腺癌患者的癌组织及配对的癌旁组织、食管正常黏膜组织。其中，癌旁组织是由有经验的手术医师和病理科医师确定距离肿瘤病灶2 cm处组织，食管正常黏膜组织是其距离癌组织≥5 cm组织。纳入患者为首次诊疗且术前无放化疗或者合并其他肿瘤。其中，男性51例，女性20例；年龄34～71岁，平均59.6岁。具有完整的病例资料，肿瘤分级、TNM分期按照国际抗癌联盟2009年第七版食管腺癌分期标准[4]。术后随访次/3个月，随访终点为死亡、失访或生存至截止日期，随访截止时间为2017年1月1日，平均随访时间29.5个月。本研究通过医院伦理委员会批准，患者及家属签订知情同意书。

1.2 组织芯片的制备

取癌组织、癌旁组织及食管正常黏膜组织以10%中性甲醛固定，常规脱水浸蜡，石蜡包埋；苏木精-伊红染色、切片、病理诊断，标记出肿瘤组织及正常黏膜组织范围。按照实验设计出组织芯片的阵列排列方式和组织类型，用10 mm组织穿刺针在每个标本的标记点取样；然后将其依次排列于模具内预融的石蜡中，构成组织微阵列蜡块，待石蜡凝固后切成4μm微阵列切片，将其贴附于载玻片上，封蜡备用。

1.3 免疫组织化学SP法

采用免疫组织化学SP法检测PTPRS蛋白的表达，具体步骤如下：组织芯片置于60℃烤箱中烘烤30 min后，经二甲苯脱蜡及乙醇水化，浸泡于3%过氧化氢H2O2抑制内源性过氧化物酶，置于柠檬酸缓冲液（pH6.0）中高压加热抗原修复3 min，羊血清室温封闭30 min，滴加PTPRS一抗（美国Sigma公司，稀释度1∶100），37℃温箱孵育1 h，加二抗酶标抗小鼠/羊IgG聚合物（上海基因科技有限公司），37℃温箱孵育30 min，3-二氨基联苯胺显色3 min，流水洗，苏木精复染，脱水、透明、中性树胶封片，镜下阅片。

1.4 结果判定

切片由2位独立观察员采用双盲法对所有切片进行评估。PTPRS蛋白主要表达在细胞膜，根据细胞膜染色强度作为评判标准。高倍镜下随机选取5个不同的视野，观察细胞染色强度及计数阳性细胞数所占细胞总数的百分比。评分标准，①按染色强度计分：无色为0分；淡黄色为1分；棕黄色为2分；棕褐色为3分。②按阳性细胞百分比计分：阴性为0分；阳性细胞数≤10%为1分；11%～50%为2分；51%～75%为3分；＞75%为4分。最后将2项得分结果相乘：总分≤4分为低表达；＞4分为高表达。

1.5 统计学方法

数据分析采用SPSS 21.0统计软件。计数资料以率（%）表示，比较用χ2检验；采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线和复发曲线，比较用Log-rank χ2检验，采用Cox回归模型评估各变量对预后的影响，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 食管腺癌、癌旁组织及食管正常黏膜组织中PTPRS蛋白表达率比较

PTPRS蛋白在食管正常黏膜组织和食管腺癌组织中表达（见图1）。PTPRS蛋白在正常食管黏膜组织、癌旁组织、癌组织中表达率分别为60.56%、52.11%和36.62%，经χ2检验，差异有统计学意义（χ2=8.376，P=0.015）；PTPRS蛋白在食管腺癌组织中表达量低于正常食管黏膜组织（P＜0.05）；癌旁组织中PTPRS蛋白表达水平与正常食管黏膜比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.2 PTPRS表达水平与食管腺癌临床病理特征的关系

不同临床分期、浸润深度、淋巴结转移状态、分化程度、神经受侵及脉管瘤栓的食管腺癌患者的PTPRS蛋白高表达率比较，差异有统计学意义（P＜0.05），而其他临床病理特征比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。PTPRS蛋白在临床分期为Ⅲ、Ⅳ期的食管腺癌组织中的低表达率[76.92%(30/39)]高于Ⅰ、Ⅱ期[46.88%(15/32)]（P＜0.05）；高分化食管腺癌患者的PTPRS高表达率高于中、低分化食管癌患者（P＜0.05）；有淋巴结转移患者PTPRS高表达率低于无淋巴结转移（P＜0.05）；浸润至纤维膜及周围组织患者PTPRS蛋白低表达率[75.56%(34/45)]高于浸润肌层以下的患者[42.31%(11/26)]（P＜0.05）。PTPRS蛋白表达水平与神经受侵、脉管瘤栓相关（P＜0.05）。食管腺癌组织中PTPRS高表达率在不同年龄、性别、饮酒史、吸烟史、肿瘤家族史、手术方式、肿瘤大小及肿瘤位置方面比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。见表1。

图1 食管正常黏膜组织及食管腺癌组织中PTPRS蛋白的表达

表1 食管腺癌临床病理特征与PTPRS表达水平的关系 [n =71，例（%）]

2.3 PTPRS蛋白表达与预后的关系

Kaplan-Meier生存分析显示，PTPRS低表达患者生存率与高表达患者生存率比较，经Log-rank χ2检验，差异有统计学意义（χ2=10.764，P=0.002）；食管腺癌患者PTPRS蛋白低表达组生存率低于高表达组（见图2）。两组患者的中位生存时间分别为24和58个月，两组患者总生存率分别为33.33%和57.69%。两组患者中位复发时间分别为20和50个月，两组患者总复发率分别为73.33%和50.00%。PTPRS蛋白低表达患者复发率与高表达患者比较，差异有统计学意义（χ2=11.468，P=0.001）；PTPRS蛋白低表达患者复发率高于PTPRS蛋白高表达患者（见图3）。经单因素Cox回归分析显示，脉管瘤栓、神经受侵、肿瘤大小、浸润深度、淋巴结转移、分化程度、临床分期及PTPRS是影响食管腺癌患者预后的危险因素（P＜0.05）；进一步多因素Cox回归分析显示，分化程度、PTPRS表达是影响食管腺癌患者预后的独立危险因素（P＜0.05）。见表2、3。

图2 食管腺癌患者术后生存时间与PTPRS蛋白表达的关系

图3 食管腺癌患者术后复发时间与PTPRS蛋白表达的关系

表2 食管腺癌预后的单因素Cox回归分析参数

表3 食管腺癌预后的多因素Cox回归分析参数

3 讨论

PTPRS基因是1988年从人胎盘基因组DNA文库首次被发现，位于染色体19p13.3[5]。其编码的蛋白PTPRS和蛋白酪氨酸磷酸酶受体F[6]、蛋白酪氨酸磷酸酶受体D[7]一样，是PTPR家族中Ⅱa亚型成员[8]，其胞外区由多种免疫球白和纤维结合素Ⅲ重复片段等组成[9]。最初发现PTPRS在神经再生、突触形成中发挥重要作用[10]。王智超等[2]研究发现，PTPRS在肝癌的发生、发展及转移中起重要作用，被认为是一个新型抑癌基因。MORRIS等[11]发现，在头颈部鳞状细胞癌中PTPRS基因的缺失可达26%，其编码的PTPRS缺失与细胞增殖、肿瘤发生和转移相关。同时MORRIS等[3]发现，PTPRS蛋白的低表达与肺腺癌预后密切相关。全基因组测序发现PTPRS基因突变，如胆管细胞癌A1384T[12]，结直肠癌V224M[13]和恶性黑色素瘤P141S[14]。DAVIS等[15]发现，PTPRS与结直肠癌的发生密切相关。提示PTPRS可能是肿瘤潜在的抑癌基因，其表达的PTPRS蛋白可能参与肿瘤的发生、侵袭及转移。

目前，关于PTPRS在食管腺癌中的表达及复发转移的研究较少。笔者对71例食管腺癌患者研究发现，PTPRS蛋白在食管腺癌组织的表达低于正常黏膜组织和癌旁组织，提示PTPRS可能是肿瘤的抑癌基因，在食管腺癌发生过程中起一定的作用。笔者进一步分析PTPRS蛋白的表达与食管腺癌患者临床病理特征的关系发现，PTPRS蛋白在早期食管腺癌组织中的表达高于晚期患者，在侵犯组织广泛及伴有淋巴结转移的患者中表达较低，提示PTPRS可能参与食管腺癌的复发转移，并与肿瘤的发生、发展密不可分。本组实验发现，PTPRS蛋白表达与肿瘤分化程度、神经受犯及脉管瘤栓相关，其在有神经浸润、脉管瘤栓的组织中的低表达率分别高达84.00%、82.61%，提示PTPRS不仅与肿瘤的恶性程度密切相关，而且与肿瘤血管形成及组织侵袭有关。PTPRS的表达量与肿瘤位置、大小无关，可能与样本量相对较少有关。

本组实验进一步探讨PTPRS蛋白表达与食管腺癌患者的生存关系。Kaplan-Meier生存曲线显示，随着时间的推移，PTPRS蛋白低表达患者生存率低于高表达患者。Cox单因素及多因素回归分析显示，PTPRS蛋白表达水平与食管腺癌患者预后相关，与PTPRS在头颈部鳞癌、肝癌及肺腺癌研究结果一致[2-3，11]。

综上所述，PTPRS可能是肿瘤的抑癌基因，其在食管腺癌的发生、发展中起着非常重要的调控作用。PTPRS在食管腺癌中确切的生物影响和分子机制仍不清楚，因此，笔者将继续增加样本量，完成术后长期随访，明确PTPRS在食管腺癌中扮演的角色，以便为食管腺癌的靶向治疗及预后监测等方面提供参考。