肺细胞外基质水凝胶治疗大鼠放射性肺损伤的实验研究*

吴鹏飞，施光清，范贤明，肖贞良，周菁

（1.西南医科大学附属医院 呼吸科，四川 泸州 646000；2.中国人民解放军西部战区总医院 呼吸科，四川 成都 610083）

放射性肺损伤是肿瘤放疗中常见的并发症，目前无有效治疗手段[1-2]。其发生包括早期炎症浸润及后期纤维化，抑制炎症反应是治疗的关键[3]。

细胞外基质（extracellular matrix，ECM）是组织再生领域的一种新型材料，是离体器官经过洗脱细胞、裂解脂膜后残余的结构和功能蛋白复合体，含有天然的胞外微环境，对细胞的增殖、调亡及免疫等生物学行为具有调节作用[4-7]。通过冻干、酶消化等将ECM制成温敏性水凝胶，即室温下为液体，37℃凝固为胶冻样，可黏附于局部组织并持续发挥作用[6]。该特性使ECM可能成为一种治疗药物，目前关于ECM水凝胶治疗肺部疾病的研究报道很少。因此，本实验通过气管内注射肺ECM水凝胶治疗大鼠放射性肺损伤研究，初步探讨其可行性及有效性。

1 材料与方法

1.1 动物及材料

1.1.1 实验动物SPF级雄性SD大鼠（成都达硕实验动物公司）42只，6周龄，体重（220±20）g，24只用于气管内注射肺ECM水凝胶的安全性评估，18只用于观察肺ECM水凝胶疗效，常规饲养，12 h昼夜交替。动物实验的设计、实施过程操作符合动物伦理。

1.1.2 仪器与材料直线加速器（美国Varian公司），冷冻切片机（英国珊顿公司），倒置相差荧光显微镜（日本Olympus公司），冷冻干燥机（北京盛超科创生物科技有效公司），冷冻研磨仪（上海净信实业发展有限公司）。苏木精及伊红染液（北京索拉宝科技有限公司），生物素（美国Thermo公司），亲和素（武汉博士德生物公司），大鼠肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素-6（Interleukin-6，IL-6）ELISA试剂盒（上海将来实业股份有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 肺ECM的制备根据SONG等[7]的肺ECM制备过程，以10%水合氯醛麻醉大鼠，12 500 u肝素+250 ml生理盐水全身灌流肝素化，18 G针行肺动脉插管，结扎、固定，紧贴脊柱完整分离肺组织，依次予以0.1 % SDS（2 h）、纯水（15 min）、1% Triton-X-100（30 min）及PBS（72 h）灌流。将所获的肺ECM制成冻干粉剂，环氧乙烷消毒后，-80℃长期保存。

1.2.2 肺ECM水凝胶的制备将10 mg/ml肺ECM粉末混入0.1 mol/L盐酸-胃蛋白酶液（1 mg/ml）中，室温搅拌消化48 h，用0.1 mol/L氢氧化钠NaOH滴定至pH 7.4，10倍PBS稀释至1倍，经体外验证，该水凝胶在常温下为液态，在37℃、30 min左右可凝结成胶冻状[8]。

1.2.3 放射性肺损伤动物模型的复制36只大鼠以10%水合氯醛麻醉后，仰卧位固定于木板上，充分暴露胸部。照射野上界为两侧腋窝中点的连线、下界为剑突下缘平面，其余部位用5 cm厚铅板遮挡，予以6MV-X线直线加速器单次照射，剂量20 Gy，剂量率3.5 Gy/min，源皮距100 cm[9]。

1.2.4 动物分组实验一：根据气管内注射剂量的不同（0、300、500及800μl），24只放射性肺损伤大鼠随机分为0μl组、300μl组、500μl组及800μl组，每组6只。实验二：18只大鼠（12只放射性肺损伤大鼠+6只正常大鼠）随机分为照射组（照射+气道内注射生理盐水500μl）、ECM组（照射+气道内注射肺ECM水凝胶500μl）及对照组，每组6只。

1.2.5 肺ECM水凝胶治疗将肺ECM水凝胶与事先配好的1 mg∶180μl纯水稀释的生物素按照93∶7的浓度混匀。照射30 min后，实验一的大鼠麻醉后固定于木板上，取仰卧位，头抬高60°，颈部皮肤竖切口0.5 cm，逐层分离暴露气管，环甲膜穿刺，用1 ml注射器分别缓慢注入300、500及800μl生物素标记的肺ECM水凝胶；实验二大鼠注入500μl肺ECM水凝胶或等量生理盐水。

1.2.6 动脉血氧分压（arterial partial pressure of oxygen，PaO2）检测在预实验中，本课题组观察到肺ECM水凝胶在体内约30 min成胶，因此在照射1 h后，实验一各组大鼠麻醉后腹主动脉取血，检测PaO2变化。

1.2.7 肺组织病理学检测实验二各组大鼠在照射7 d后取左肺，4%多聚甲醛固定24 h后，常规脱水、石蜡包埋及切片，苏木精-伊红（HE）染色，镜下观察肺组织病理改变。参考MIKAWA等[10]的评分方法评价肺损伤程度，包括：①肺泡充血；②肺泡水肿；③肺泡壁中性粒细胞浸润；④肺泡壁增厚。根据损伤程度分为：无损伤0分，每高倍镜视野下损伤范围＜25%计1分，25%～＜50%计2分，50%～＜75%计3分，≥75%计4分，每项最高4分，总分最高16分。

1.2.8 免疫荧光染色检测实验一300、500及800μl组大鼠照射1 h后取左肺，OCT冷冻切片包埋剂包埋后冷冻切片，PBS清洗3次，3 min/次、5%牛血清清蛋白封闭30 min，PBS清洗3次，3 min/次、亲和素反应30 min，PBS清洗3次，3 min/次，DAPI染色3 min，PBS清洗3次，3 min/次，抗荧光淬灭剂封片后观察。

1.2.9 血清TNF-α、IL-6浓度检测照射7 d后，实验二各组大鼠腹主动脉取血3 ml，常温静置1 h，3 500 r/min离心15 min，取上清0.5 ml。血清TNF-α、IL-6含量检测按照ELISA试剂盒说明书操作，酶标仪450 nm波长处测定吸光度值。

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 16.0统计软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用方差分析，进一步两两比较用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肺ECM支架

离体肺组织颜色红润，脱细胞液灌流后的肺ECM，肉眼观察肺组织大体标本变透明，HE染色未见蓝染的细胞核成分，绝大多数已经洗脱肺组织有核细胞成分。见图1。

图1 肺ECM支架

2.2 各组大鼠PaO2比较

实验一大鼠气管注射肺ECM水凝胶后30 min内，800μl组大鼠死亡3只，存活率为50%，0、300及500μl组无死亡，存活率均为100%。注射30 min后，0、300、500及800μl组大鼠PaO2分别为（84.51±7.78）、（81.96±9.97）、（79.29±7.56）和（61.51±8.39）mmHg，经方差分析，差异有统计学意义（F=30.241，P=0.000）；0μl组与300μl组大鼠PaO2比较，差异无统计学意义（t=0.951，P=0.345），0μl组与500μl组大鼠PaO2比较，差异无统计学意义（t=1.947，P=0.055），300μl组与500μl组大鼠PaO2比较，差异无统计学意义（t=0.996、P=0.323），300μl组与800μl组大鼠PaO2比较，差异有统计学意义（t=7.629，P=0.000）。说明气管注射肺ECM水凝胶300和500μl不会影响大鼠PaO2，而800μl则会影响大鼠PaO2。

2.3 各组大鼠肺泡内ECM水凝胶的分布

300、500及800μl组能在肺泡表面观察到绿色荧光。800μl组观察到部分水凝胶在气道内滞留，300和500μl组未见气道滞留，且前者比后者肺泡内绿色荧光分布更均匀、广泛。见图2。

2.4 各组大鼠肺组织病理学观察及评分比较

照射7 d后通过光镜观察，与对照组比较，照射组大鼠肺泡间隔充血水肿、增宽，细胞浸润增多，肺泡腔可见渗出，气管内注射肺ECM水凝胶后，上述病理改变减轻（见图3）。照射7 d后，对照组、照射组及ECM组的肺组织病理评分分别为（0.90±0.31）（5.50±1.95）和（3.50±0.85）分，经方差分析，差异有统计学意义（F=34.282、P=0.000）；照射组与对照组肺组织病理评分比较，差异有统计学意义（t=-7.336，P=0.000），ECM组与照射组肺组织病理评分比较，差异有统计学意义（t=2.437，P=0.033）。说明气管内注射肺ECM水凝胶能减轻放射性肺损伤早期的病理改变。

图2 大鼠肺泡中肺ECM水凝胶的分布情况 （免疫荧光染色×400）

2.5 各组大鼠血清TNF-α、IL-6水平变化

对照组、照射组和ECM组大鼠血清TNF-α分别为（57.11±9.11）、（98.79±12.12）和（74.49±20.17）pg/ml，对照组、照射组和ECM组大鼠血清IL-6分别为（35.14±4.25）、（75.67±9.22）和（53.49±8.40）pg/ml，各组大鼠血清TNF-α、IL-6比较，差异有统计学意义（F=25.088和71.172，均P=0.000），照射组及ECM组大鼠血清TNF-α、IL-6水平较对照组升高（P＜0.05），ECM组大鼠血清TNF-α、IL-6水平较照射组降低（P＜0.05）。见图4。

图3 肺组织病理学观察 （HE染色×200）

图4 各组大鼠血清TNF-α、IL-6水平比较 （n =6，±s）

3 讨论

ECM材料是近年来组织再生领域研究的热点之一，其免疫源性低，含有最天然的细胞外微环境，是种子细胞生长的理想材料[11]。同时，含有大量活性因子，体外研究表明ECM对组织细胞的行为具有多项调节作用，因此可能在组织局部发挥抗炎、免疫调节、抗纤维化及改善血管形成等多种生理作用[5，12]。近年来研究报道，将ECM制备成可注射的ECM水凝胶，局部注射后直接作用于受损组织表面，对受损脑、心肌及皮肤等有治疗作用[4，12]。GHUMAN等[13]将猪膀胱ECM水凝胶注射到大鼠脑梗死区域，当水凝胶浓度为8 mg/ml时，损伤区域宿主细胞浸润明显，其中60%为脑源性细胞，能显著发挥内源性修复作用。SUN等[14]发现碳纳米管复合水凝胶能促进心肌细胞闰盘形成，增强其与周围心肌细胞的黏附作用。目前，ECM水凝胶应用于肺损伤等相关疾病的研究很少。放射性肺损伤多发生在胸部肿瘤放疗后或核辐射暴露后，是临床治疗的难点之一。如何减少细胞坏死，减轻炎症反应，成为其早期治疗的关键[3]。既往研究表明，肺组织受照射后1 h内即启动早期炎症反应[15]。本实验研究提示ECM水凝胶有抗炎作用，早期给药减轻局部炎症反应，对放射性肺损伤产生治疗作用。

本研究首先利用脱细胞方法[7]制备肺ECM支架，HE染色证实脱细胞效果满意，然后按照WOLF等[8]和PRICE等[16]报道的方法将ECM支架制成温敏性水凝胶。在预实验中，将材料注射到大鼠皮下，观察周围炎症反应，HE染色未见局部出血或细胞渗出增多，组织相容性好。

实验时ECM水凝胶给药量和给药方式至关重要。一方面大鼠气管直径小，注射量过大存在窒息风险，肺ECM水凝胶在终末气道分布过多，会影响肺组织气体交换。另一方面，为确保给药效果，应使水凝胶充分、均匀地附着在肺泡表面。本研究采用环甲膜穿刺、气管内注射的精确给药方式，结果显示注射500μl肺ECM水凝胶后，水凝胶在肺泡表面均匀、充分分布，且不会造成大鼠死亡率上升，确定给药方式和剂量安全有效。杨文等[17]在检测KM小鼠气管注射耐受量时发现，32 g左右的KM小鼠，气管内注射生理盐水的剂量为3.814～4.768 ml/kg时，小鼠死亡率为40%～50%，比本实验结果稍低，可能是由于ECM凝结成胶后较生理盐水对通气及换气功能的影响更大。血清TNF-α、IL-6水平在放射性肺损伤早期就显著升高，且与局部肺组织损伤程度相关[18]。本实验观察到，早期气管内注射肺ECM水凝胶抑制血清TNF-α、IL-6的表达，降低大鼠局部肺组织损伤病理评分，初步显示ECM水凝胶局部给药有一定的疗效和研究价值。

本实验成功获取了肺ECM水凝胶，复制气管内注射肺ECM水凝胶治疗大鼠放射性肺损伤模型，并初步验证其对放射性肺损伤的疗效。肺ECM水凝胶对放射性肺损伤的保护作用和机制仍有待进一步研究，以明确其对肺水肿、肺组织细胞凋亡和肺部炎症反应等的干预作用。