慢性根尖肉芽肿中TNF-α与IL-34表达的相关性*

朱永娜，陈直，宋伟，张晓东

（1.蚌埠医学院第二附属医院 口腔科，安徽 蚌埠 233000；2.蚌埠医学院，安徽 蚌埠 233000）

慢性根尖肉芽肿是一种以炎性骨吸收为特征的常见疾病[1]。肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）对该病有重要的调节作用，可调节破骨细胞分化成熟，调节骨吸收[2-4]。白介素-34（Interleukin-34，IL-34）是一种新型炎症因子，该因子的表达受TNF-α的调节[5-6]。TNF-α和IL-34均可以调节慢性根尖肉芽肿中的骨吸收[7-8]，但慢性根尖肉芽肿中IL-34与TNF-α的关系还不清楚。因此本研究拟初步探讨慢性根尖肉芽肿中两者表达的相关性，以进一步研究TNF-α的致病机制，为后期临床治疗提供一定的理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2018年3月—2018年5月就诊于蚌埠医学院第二附属且医院临床及影像学诊断为慢性根尖肉芽肿的患者，收集患牙拔除时的病损软组织13例作为实验组。纳入标准：①患者近2个月内未应用抗生素及非甾体类药物；②患者无高血压、糖尿病等系统性疾病，无其他口腔疾病；③患者的患牙无牙髓活力，无法保留，需要拔除；④X射线诊断患牙为慢性根尖肉芽肿；⑤患者无拔牙禁忌证。另选取本院同期就诊拔除阻生牙时切除的健康牙龈组织8例作为对照组（符合纳入标准中的①②⑤）。

1.2 方法

1.2.1 苏木精-伊红（HE）染色将收集的软组织用去离子水冲洗3 min，置于4%的甲醛中固定24 h，石蜡包埋备用。将石蜡切成4μm厚的连续切片，然后按HE步骤进行染色。封片后，倒置显微镜下观察染色结果，判定标本类型。根尖肉芽肿的病理诊断标准为：可见以大量炎症细胞、毛细血管和成纤维细胞增生为主的炎症肉芽组织。筛选影像学和病理诊断一致并且符合要求的标本，最终获得实验组9例。

1.2.2 链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连接（streptavidin-perosidase，SP）法将符合要求的石蜡包块切成4μm厚切片。切片脱蜡、复水及抗原修复。用3%过氧化氢液阻断内源性过氧化氢酶。滴加一抗50μl于4℃避光过夜孵育（IL-34抗体和TNF-α分别用抗原稀释液1∶100和1∶500稀释）。每张切片滴加兔抗人二抗50μl孵育20 min，加入二氨基联苯胺显色液在显微镜下观察，至染色效果理想时终止染色。苏木精复染3 min。切片脱水、透明，每步之间均要用磷酸盐缓冲液充分洗涤切片。中性胶封片后在倒置显微镜下拍照观察。阴性对照为肉芽肿组织，用磷酸盐缓冲液代替一抗孵育切片作为阴性对照组。

阳性判断标准为细胞核、细胞质或细胞膜上出现黄色或棕色颗粒。每张切片随机选5个视野拍照，并用Image-J软件进行分析。

1.3 影像学诊断标准

患牙根尖、根侧方或根分叉处有直径＜1 cm的低密度影像，并且边界清晰，周围骨质正常或者稍微变致密[9]。

1.4 统计学方法

数据分析采用SPSS 20.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用t检验，相关性分析用Pearson法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组病理检查结果比较

慢性根尖肉芽肿中见大量炎症细胞浸润，包括中性粒细胞、淋巴细胞及浆细胞等，并伴有新生血管形成（见图1A）。健康牙龈见大量纤维组织，炎症细胞较少（见图1B）。

图1 两组患者病理切片图 （HE×20）

2.2 各组TNF-α、IL-34相对表达量比较

实验组和对照组可见TNF-α表达，主要表达于细胞浆及细胞核上。实验组和对照组TNF-α相对表达量分别为（0.246±0.059）和（0.158±0.017），经t检验，差异有统计学意义（t=4.274，P=0.002），实验组高于对照组（见图2）。实验组和对照组可见IL-34表达。实验组和对照组IL-34相对表达量分别为（0.206±0.038）和（0.131±0.023），经独立样本t检验，差异有统计学意义（t=4.867，P=0.000），实验组中IL-34表达较高（见图3）。阴性对照组中两者均无表达。

图2 各组TNF-α的表达 （SP法×40）

图3 各组IL-34的表达 （SP法×40）

2.3 IL-34和TNF-α表达的相关性

经Pearson相关检验，实验组TNF-α与IL-34呈正相关（r=0.896，P=0.001），对照组TNF-α与IL-34无相关性（r=0.186，P=0.659）。

3 讨论

TNF-ɑ是在病原菌、内毒素或相关物质诱导下，由单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞等分泌的一种促炎因子，在骨吸收中发挥重要作用[10]。有报道在小鼠的根尖病损中发现TNF-α的表达，用药物抑制小鼠的根尖病损后，小鼠病损组织中TNF-α的表达也受到抑制[11-12]。KIMAK等[13]在人根尖病损组织中也多次检测到TNF-α的表达。本研究在慢性根尖肉芽肿中发现TNF-α的表达高于对照组，与之前结果一致。

本研究发现在慢性根尖肉芽肿中IL-34的表达高于对照组。2013年有学者报道牙周炎患者牙周膜细胞中IL-34的表达较高[14]。CHEMEL等[15]证实RA患者的滑膜中IL-34的表达较健康人高，本文的慢性根尖肉芽肿中IL-34表达较高，与前两者一致。这可能因为慢性根尖肉芽肿与牙周炎及类风湿性关节炎有共同特征（均伴有炎性骨破坏）有关。破骨细胞在骨改建中负责骨吸收，核因子κB受体活化因子配体和其配体结合后能够促进破骨细胞的增殖、分化及成熟，促进促吸收。集落刺激因子（colony stimulating factor，CSF-1）与其配体结合后能够协同核因子κB受体活化因子配体诱导破骨细胞的分化，增加其活性。IL-34和CSF-1拥有共同的配体。IL-34可以代替CSF-1协同核因子κB受体活化因子配体调节破骨细胞的分化成熟，促进骨吸收。在类风湿关节患者血清中，IL-34与核因子κB受体活化因子配体的表达呈正相关，且两者均与骨密度水平呈负相关。可以看出IL-34主要通过核因子κB受体活化因子配体参与骨组织的破坏吸收。IL-34在慢性根尖肉芽肿中对根尖骨组织的破坏可能与核因子κB受体活化因子配体有关。

CHEMEL[15]和HWANG等[16]分别报道，在类风湿性关节炎患者的滑膜组织及滑膜成纤维细胞中存在IL-34的表达，且TNF-α可以促进IL-34的表达。RANKL在慢性根尖周炎的骨破坏中扮演重要角色，TNF-α、IL-34可通过调节核因子κB受体活化因子配体调节骨吸收。TNF-α在慢性根尖肉芽肿中除可以直接通过核因子κB受体活化因子配体调节骨破坏外，还可能通过IL-34间接调节其活性，调节炎性骨破坏[17-18]。有学者发现，TNF-α拮抗剂在临床上能有效减轻类风湿性关节炎患者的骨组织破坏[19]。动物实验发现，TNF-α拮抗剂可以减轻伴糖尿病小鼠的牙周炎症[20]。本研究进一步揭示TNF-α在慢性根尖肉芽肿中的作用机制，为后期临床应用TNF-α拮抗剂治疗慢性根尖肉芽肿提供一定的理论依据。