高效液相色谱串联质谱法测定红糖中3-硝基丙酸

高裕锋，庞扬海，甄振鹏，黄敏兴，余构彬，郭剑雄

(1广东省生物工程研究所(广州甘蔗糖业研究所) 广东省甘蔗改良与生物炼制重点实验室，广东广州510316；2国家糖业质量监督检验中心，广东广州510316)

0 引言

3-硝基丙酸可由霉变甘蔗中的病原菌甘蔗节菱孢霉产生，是一种强烈的嗜神经毒素，可对中枢神经系统产生严重的损伤[1-3]。人在摄入含有3-硝基丙酸的食物后，首先经胃肠道吸收，随后分布于肝、肾组织中，且能透过血脑屏障进入脑组织并富集[3]。红糖是目前市面上较受欢迎的食糖品种之一，其生产工艺比较简单，保留了原料甘蔗的很多物质，红糖的质量安全问题一直是人们关注的热点[4-5]。如果红糖的生产过程使用了霉变甘蔗进行加工，有可能导致3-硝基丙酸在红糖中残留，引发食品安全风险，因此开发红糖中3-硝基丙酸的检测方法具有重要的意义。

目前，针对甘蔗中3-硝基丙酸的检测方法有离子色谱法、毛细管电泳法、液相色谱法、高效液相色谱串联质谱法等[6-10]，对于食糖产品中的检测方法并无报道。与色谱方法比较，高效液相色谱串联质谱法可实现准确定性且具有较高的灵敏度[10]。本文将采用超高效色谱串联质谱法建立红糖中3-硝基丙酸的检验方法，并对目前市面上销售的红糖中残留情况进行了初步的调研。该方法操作简单，检出限和灵敏度符合食品安全检验的要求。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

高效液相色谱串联质谱仪AB 5500 Q-Trap (美国AB SCIEX公司)；超纯水机UPC-I-60L型(成都超纯科技有限公司)；大容量冷冻离心机CL5R(湖南湘仪离心机仪器有限公司)；多位试管涡旋振荡器Multi Reax(德国 Heidolph公司)；超声波清洗机SB25-12 DTD (宁波新芝生物科技股份有限公司)；氮吹仪N-EVAP112 (美国Organomation公司)；电子天平JE3002GE(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)。

3-硝基丙酸(99.99%，上海安谱实验科技股份有限公司)；甲酸(分析纯，广州化学试剂厂)；甲醇(色谱纯，德国默克股份两合公司)；无水乙醇(分析纯，广州化学试剂厂)；氨水(25%，广州化学试剂厂)；0.22 μm有机相滤膜(彼西络科技(广州)有限公司)；PWAX固相萃取柱(天津博纳艾杰尔科技有限公司)。所用红糖样品均在市面随机购买。

1.2 标准溶液配制

准确称取3-硝基丙酸标准品10.0 mg于10 mL棕色容量瓶中，10%甲醇-0.1%甲酸水混合溶剂定容，配制成质量浓度为1000 mg/L的标准储备液，于 4℃条件下保存。取上述标准储备液逐级稀释，用 10%甲醇-0.1%甲酸水定容，配制成浓度为 20、10、5、1、0.5、0.2、0.1 μg/L 的溶液。

1.3 提取和净化

准确称取2.00 g红糖样品于50 mL离心管中，加入10 mL乙醇-水(9∶1)，充分涡旋5 min，在4900 r/min转速的离心机下离心5 min；取3 mL上清液于50 mL离心管中，加入3 mL超纯水，充分涡旋5 min，待净化。PWAX固相萃取柱先加入3 mL甲醇，再加入3 mL超纯水活化后，取4 mL试样溶液过柱，先用5 mL超纯水淋洗，再用10 mL 10%氨化甲醇洗脱，收集洗脱液。经氮气吹干后，用2 mL10%甲醇-0.1%甲酸水复溶，超声20 min，过0.22 μm滤膜至进样瓶中，待LC-MS/MS检测。

1.4 LC-MS/MS分析

1.4.1 LC条件

色谱柱：Luma Omega C18柱(1.6 μm，100 mm×2.1mm)，柱温 40℃；进样量：2 μL；流动相 A：超纯水，流动相B：甲醇；梯度洗脱程序见表1。

表1 液相色谱梯度洗脱程序

1.4.2 质谱条件

电离模式：ESI-；仪器参数：气帘气压力 40.0 kPa，碰撞气压力中档，离子喷雾电压-4500.0 V，离子源温度550℃，雾化气压力50.0 kPa，辅助加热气压力 50.0 kPa，接口加热器为开；采集模式：多反应监测MRM，具体参数如表2所示。

2 结果与讨论

2.1 色谱和质谱条件选择

由于使用反相色谱柱对 3-硝基丙酸进行分离时，3-硝基丙酸具有很强的酸性和亲水性，在反相柱上保留较弱，因此需要使用磷酸二氢钾溶液作为流动相。但是液相质谱联用对不挥发性盐类耐受性较差，一般情况下禁止使用任何不具有挥发性的缓冲盐作为流动相，所以本实验考察了适合保留极性物质的色谱柱 ACQUITY UPLC HSS T3和 Luma Omega C18对3-硝基丙酸分离效果。图1显示，就保留时间而言，2种色谱柱均在1.50 min左右，但从峰型来看，T3柱的峰型稍有拖尾，且对称性不如C18柱，故最终选用Luma Omega C18作为色谱柱。

质谱条件优化方法是：在注射泵直接进样的条件下，在负离子模式下进行母离子全扫描，确定3-硝基丙酸的分子离子峰，然后以该分子离子峰为母离子，对其子离子进行全扫描，获得二级质谱响应较强的子离子，最后以多反应监测模式进行采集，并获得去簇电压和碰撞能量等相关参数，具体参数如表2所示，使所测的质谱峰强度最优。

表2 3-硝基丙酸的MRM质谱参数

图1 3-硝基丙酸标准溶液(10 μg/L)的MRM谱图

2.2 提取方法和净化方式选择

通过加标回收试验，比较不同比例的乙腈-水、甲醇-水、乙醇-水作为提取溶剂对回收率的影响，综合考虑溶剂的毒性和价格，选用乙醇-水(9∶1)作为提取溶剂。

红糖基质主要是蔗糖和其他有色杂质，需要对样品进行净化处理才能得到较高的回收率，并保护色谱柱。3-硝基丙酸是一种极性小分子且具有酸性、亲水性等特性，选用混合型弱阴离子交换小柱PWAX固相萃取柱作为净化柱。该固相萃取柱对强酸性化合物有很好的选择性，可以起到富集除杂的效果。样品经PWAX固相萃取柱富集后需要通过淋洗来除去杂质，从而达到净化的目的。淋洗剂通常选择甲醇、水或甲醇-水混合溶剂，回收率试验表明(如表3所示)，以甲醇-水混合溶剂作为淋洗液都可以达到90%以上的回收率，综合考虑溶剂的毒性和水对蔗糖基质的去除效果，选择以水作为淋洗剂。

2.3 方法线性范围和检出限

表3 淋洗液中甲醇含量对3-硝基丙酸回收率的影响

用0.1～20.0 μg/L标准工作溶液进样分析，根 据标准物质浓度(x)和峰面积(y)计算的线性方程见表4。结果表明，3-硝基丙酸标准曲线的相关系数为1.0000，线性良好。方法检出限(LOD)以空白样品基质稀释标准曲线上的最低浓度出峰时，取信噪比S/N=3计算得出。定量限(LOQ)是以空白样品基质稀释标准曲线上的最低浓度出峰时，取信噪比S/N=10计算得出。3-硝基丙酸检出限0.057 μg/kg，定量限为0.189 μg/kg(表4)，可以满足3-硝基丙酸痕量分析的需要。

表4 3-硝基丙酸的方法检出限、定量限、线性范围、线性方程和相关系数

2.4 回收率和精密度

分别准确添加3-硝基丙酸标准溶液于阴性红糖样品中，设3个添加浓度，每个浓度分别做6次重复实验，按上述方法测定，以得到的平均回收率评价分析方法的准确度，以6次测试结果的相对标准偏差评价方法的精密度。添加水平为 2.5、10、50 μg/kg，平均添加回收率在 79.2%～85.5%之间，相对标准偏差在 5.2%～7.3%之间(见表 5)，符合残留分析的要求。

2.5 实际样品测试

表5 红糖中3-硝基丙酸平均回收率和精密度数据表(n=6)

按上述方法检测了在市面上随机购买的 20份红糖样品，其中19个样品未检出3-硝基丙酸，有1个样品检出，检出值为1.16 μg/kg。这表明一方面霉变甘蔗产生的 3-硝基丙酸有可能残留到红糖产品中；另一方面，3-硝基丙酸的人体中毒剂量为12. 5 mg/kg[8]，以成人体重60 kg计算，中毒剂量约为750 mg，据此推算该红糖的残留值在正常食用条件下不会对人体造成中毒的危害。

3 结论

通过对前处理方法和色谱质谱条件的优化，建立了红糖中3-硝基丙酸的高效液相色谱串联质谱检测方法，结果表明，3-硝基丙酸在 0.1～20 μg/L浓度范围内线性关系良好，该方法的检出限为 0.057 μg/kg，定量限为 0.189 μg/kg，在 2.5、10、50 μg/kg的加标水平下，平均回收率为79.2%～85.5%。该方法前处理简单，检测灵敏度高、准确性好，可用于红糖中3-硝基丙酸的批量检测。