氮、磷、钾胁迫对甘蔗生长及固氮酶活性的影响

黄晓财，胡浩南，李欣欣，敖俊华1,*，廖 红

(1广东省生物工程研究所(广州甘蔗糖业研究所) 广东省甘蔗改良与生物炼制重点实验室，广东广州510316；2华南农业大学，广东广州510642；3福建农林大学根系生物学研究中心，福建福州350002)

0 引言

甘蔗是我国重要的糖料和能源作物，在人们日常生活和国家经济发展中起着举足轻重的作用。氮(N)、磷(P)和钾(K)是农业肥料三要素，是植物生长发育所必需的大量营养元素。每生产1 t甘蔗需要获取1.5～2 kg的N、1～1.5 kg的P以及2～2.5 kg的K[1]。N、P、K 的缺乏会严重抑制甘蔗生长、降低其生产力[2-3]。例如，缺氮能使甘蔗叶片黄化，植株矮小[3]；缺磷使甘蔗叶片花青素积累，抑制蔗茎及根系生长，影响光合导致糖分含量下降[4]；缺钾使甘蔗中脉变红，阻碍光合作用，降低转化酶活性，降低分蘖数，植株瘦弱[5]。为提高或维持甘蔗产量，毋庸置疑，施肥是最直接、最快速的手段。然而，近年来由于不合理或过度施肥，不仅增加了农业成本而且对人类赖以生存的生态环境造成严重破坏[6-7]。因此，研究不同施肥条件对甘蔗生长的影响，挖掘植物自身潜力结合合理的施肥措施，是提高甘蔗产量和品质的有效途径。

甘蔗是重要的联合固氮作物[8]。研究表明，某些甘蔗品种可从生物固氮系统中获取所需氮量的60%～70%[9]；同时，接种固氮菌，能显著提高甘蔗根及地上部的氮含量和生物量[10-11]，这暗示了联合固氮作用在甘蔗生产及可持续生态农业中的重要性。内生固氮菌种类较多，且能够定殖于甘蔗不同组织部位，包括根、茎和叶[12-14]。不同组织部位中固氮菌的固氮酶活性存在明显差异，固氮酶活性亦是衡量生物固氮效率较为重要的指标之一。然而，关于不同施肥处理对甘蔗固氮酶活性的影响的报道比较少见。本研究利用土培法，比较分析了粤糖93-159和 ROC22在不同施肥条件下的营养生长及固氮酶活性的变化，以期为甘蔗营养研究、养分管理及联合固氮系统与养分相关联的基础研究提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 植株材料

供试甘蔗品种：ROC22、粤糖93-159。ROC22是台湾糖业研究所利用母本ROC5和父本69-463培育而成，于1998年引入大陆并大面积种植，该品种中熟、高糖，现为我国种植面积最大的甘蔗品种；粤糖 93-159由广州甘蔗糖业研究所利用母本粤农73-204和父本CP72-1210育成，该品种特早熟高糖，在我国蔗区广泛种植。

挑选长势一致的甘蔗种茎，斩成长短一致的单芽苗，经300倍多菌灵稀释液浸泡5 min后，摆放于装有河沙的育苗盘内，待第4片真叶完全展开时，作为供试种苗。

1.1.2 供试土壤

试验土壤取自粤西蔗区，土壤类型为砖红壤，土壤pH 4.9，有机质20.11 g/kg，全氮0.62 g/kg，全磷0.50 g/kg，全钾2.67 g/kg，碱解氮33.30 mg/kg，速效磷≤5.00 mg/kg，速效钾35.22 mg/kg。

1.1.3 试验种植槽

试验种植槽为1 m×1 m×1.2 m (长×宽×深)的水泥槽，每槽装供试土壤1 m3，移栽甘蔗种苗12株。肥料施用采用面积换算，施用量为农民田间常规施用量的 2.5倍，农民田间常规施用量为 N 498 kg/hm2、P2O5324 kg/hm2、K2O 540 kg/hm2。

1.2 试验方法

1.2.1 不同甘蔗品种的施肥处理

试验设 4个施肥处理，3次重复。施肥处理包括：不施氮肥处理(-N)，即磷肥(P2O5)81.00 g/槽和钾肥(K2O)135.00 g/槽；不施磷肥处理(-P)，即氮肥(N)124.20 g/槽和钾肥(K2O)135.00 g/槽；不施钾肥处理(-K)，即氮肥(N)124.20 g/槽和磷肥(P2O5)81.00 g/槽；氮磷钾处理(NPK)，即氮肥(N)124.20 g/槽、磷肥(P2O5)81.00 g/槽、钾肥(K2O)135.00 g/槽。磷肥为过磷酸钙(P2O512%)，在基肥时一次性施入；氮肥为尿素(N 46%)，钾肥为氯化钾((K2O 60%)，分基肥和分蘖期追肥2次施用，2个时期施用比例分别为30%和70%。

供试甘蔗于2016年1月份移植，9月中旬测试甘蔗株高、茎径并取样，每株甘蔗从肥厚带处剪取+4叶(甘蔗最高可见肥厚带往下数的第4片叶，依此类推)和植株新鲜根系测定其固氮酶活性。

1.2.2 固氮酶活性测定

参考Kirchhof等[15]培养基方法，利用LGI培养基测定甘蔗固氮酶活性。其成分主要包括：K2HPO40.20 g/L、KH2PO40.60 g/L、MgSO4·7H2O 0.20 g/L、CaCl2·2H2O 0.02 g/L、NaMoO4·2H2O 0.002 g/L、FeCl3·6H2O 0.01 g/L、蔗糖 100.00 g/L。

参照 Roesch等[16]及桂意云等[12]方法，分别将不同品种甘蔗的根，+4叶用自来水及无菌水冲洗后，再用剪刀切碎混均匀，并称取1 g左右样品，转入60 mL培养瓶中，分别加入10 mL上述LGI培养液，进行培养48 h后，用针筒抽出1 mL气体并同时注入等体积的乙炔继续培养 24 h，随后加入50%三氯乙酸1 mL终止反应，并使用气相色谱仪测定形成乙烯的量。每个部位3个生物学重复。以nmol(C2H4)·g-1(Fw)·h-1表示固氮酶活性大小，计算公式如下：

其中，C：标准曲线上对应的乙烯浓度(g/L)；V1：瓶子的体积(L)；V2：装样品所占用的体积(L)；M：乙烯分子量；FW：样品鲜重(g)；H：加入乙炔后培养的时间(h)。

1.2.3 N、P、K浓度测定

将不同处理的甘蔗+2叶105℃杀青30 min后，75℃恒温烘干粉碎。氮、磷使用连续流动分析仪(型号为SAN++，产自荷兰)测定；K使用火焰分光光度计测定。

1.3 数据分析

应用Microsoft Excel 2007进行数据计算，采用SigmaPlot进行作图，SPSS 16.0用于数据统计分析。

图1 不同施肥处理对不同甘蔗品种生长的影响

2 结果与分析

2.1 不同施肥处理对甘蔗生长的影响

2.1.1 不同施肥处理对甘蔗株高和分蘖直径的影响

分析粤糖93-159和ROC22在不同施肥条件下的株高及茎径的变化，结果如图1所示，不施氮肥(-N)显著抑制了甘蔗生长，粤糖 93-159和 ROC22的株高(图1A)和茎径(图1B)均明显低于氮磷钾处理(NPK)，粤糖 93-159的株高和茎径分别降低了74.49%、17.48%，ROC22降低了78.28%、68.75%；在不施磷肥(-P)处理下，粤糖 93-159的株高显著低于NPK，而-P并未影响ROC22的株高以及2个甘蔗品种的茎径；不施钾肥(-K)处理的 2个甘蔗品种株高和茎径与NPK处理具有相似的趋势，品种内无显著差异。另外，无论哪种施肥条件，ROC22的株高要显著高于粤糖93-159(图1A)，而-N处理下，粤糖93-159的茎径要明显高于ROC22。通过不同施肥条件的比较分析，说明缺氮会严重抑制甘蔗生长发育。

2.1.2 不同施肥处理对不同甘蔗有效茎数的影响

不同施肥处理对甘蔗有效茎数的影响结果分析表明(表 1)：-N和-P显著减少了不同甘蔗品种的有效茎数。在-N条件下，粤糖93-159和ROC22的有效茎数分别降低了 78.0%和 64.7%；在-P条件下，分别降低了 68.3%和 58.8%。在-K条件下，粤糖93-159的有效茎数降低了41.5%，而对ROC22无显著影响。此外，在同一施肥水平下，粤糖93-159的有效茎数均要多于ROC22，暗示了粤糖93-159可能具有较高的氮磷钾养分效率。

表1 不同甘蔗品种在不同施肥条件下的有效茎数

2.2 不同施肥处理下甘蔗叶片N、P、K浓度的变化

甘蔗+2叶为甘蔗最高可见肥厚带往下数的第2片叶，其为甘蔗的重要功能叶片。通过分析不同施肥条件下甘蔗+2叶片的 N、P、K浓度，结果发现不同施肥处理对不同甘蔗品种的养分浓度影响不同。-N处理提高了粤糖93-159和ROC22的+2叶N浓度(图 2A)，与对照相比，分别增加了 45.4%和15.3%。粤糖93-159在-P和-K条件下，甘蔗+2叶N浓度与对照相比，表现相反的差异：-P处理下，其+2叶N浓度降低了21.2%，-K条件下的N浓度提高了28.8%；然而，ROC22在-P和-K处理下+2叶的N浓度与NPK相比无显著差异。

不施磷肥显著降低了甘蔗+2叶的 P浓度(图2B)。与对照相比，粤糖93-159和ROC22的+2叶P浓度分别降低了58.7%和28.0%。而不施氮肥时，显著增加了2种甘蔗品种+2叶的P浓度，粤糖93-159的P浓度较对照增加了211.1%，ROC22的P浓度较对照增加了 30.3%。然而，不施钾肥处理下，粤糖93-159和ROC22的+2叶P浓度与对照相比，无明显差异。

由图2C可知，不施钾肥条件下，ROC22+2叶的K浓度较对照降低了50.2%；而粤糖93-159的+2叶K浓度虽然存在下降趋势，但与 NPK相比无显著差异。然而，在-N条件下，粤糖93-159和ROC22的+2叶 K浓度均显著增加，分别提高了 46.3%和32.8%。在不施磷肥条件下，2种甘蔗品种+2叶的K浓度与对照相比，无显著差异。

2.3 不同施肥处理对甘蔗根和叶固氮酶活性的影响

利用 LGI培养基培养不同品种甘蔗根系及+4叶，并测定其固氮酶活性。结果如图 3A所示，不施氮肥时，显著提高ROC22根系的固氮酶活性，而粤糖93-159根系的固氮酶活性提高不明显。在不施磷、钾肥及对照条件下，ROC22的固氮酶活性均较低；粤糖93-159在不同施肥条件下根系的固氮酶活性相对较高，总体变化趋势是-N＞NPK＞-K＞-P。

在+4叶中，粤糖 93-159的固氮酶活性在不施氮肥条件下最高，为 302.27 nmol (C2H4)·g-1(Fw)·h-1；其次是不施磷和钾肥处理，而对照条件下的固氮酶活性最低。然而，ROC22的+4叶固氮酶活性在不施磷肥条件下最高；不施氮肥亦能提高其固氮酶活性，比NPK提高了144.0%；不施钾肥处理抑制了ROC22的固氮酶活性，NP较NPK降低了76.3%。说明，不同施肥条件对不同甘蔗品种的内生固氮菌菌落存在不同程度的调控，进而不同程度地影响了固氮酶活性。

3 讨论与结论

甘蔗是高光效的 C4作物，生长周期长，生物量高，对养分需求大。众所周知，氮、磷和钾是植物生长发育所必需的大量营养元素。其中，氮是构成蛋白质的主要成分，是植物需求量最大的矿质养分；磷是细胞结构物质，是磷脂、核酸和核蛋白等的重要组分；钾参与植物生理生化代谢过程，维持某些代谢酶的活性。然而，土壤养分有效性低往往是限制甘蔗产量的主要因素之一。挖掘作物自身潜力，结合合理施肥措施是提高产量经济有效的策略。本研究设置了不施氮肥、不施磷肥、不施钾肥和对照4个处理，分析了在不同处理下，不同甘蔗品种的生长及固氮酶活性变化。我们的结果显示，在不施氮肥条件下，显著抑制了粤糖 93-159和 ROC22的株高(图 1A)、茎径(图 1B)及有效茎数(表 1)；不施磷肥处理，显著抑制了不同甘蔗品种的株高(图1A)和有效茎数(表1)，对甘蔗茎径(图1B)影响不大；不施钾肥处理，除影响粤糖 93-159的有效茎数外，2种甘蔗的生长状态与对照相比，无明显差异。说明，甘蔗的生长依赖土壤氮、磷、钾的供给；同时也暗示了，甘蔗本身可能对钾具有一定的活化作用。

图2 不同施肥处理对不同甘蔗品种+2叶中氮、磷及钾浓度的影响

施肥不仅能影响植物本身生长发育过程，同时能改变土壤微生物群落[17]。甘蔗与固氮微生物形成的联合固氮系统，受氮营养的调控作用，一般而言，低氮能促进生物固氮的发生[18]。同时，研究发现，田间氮肥用量的多少直接影响了内生固氮菌在甘蔗体内存在的数量，进而影响了固氮作用[19]。此外，接种内生固氮菌，能够显著提高植株根系和叶的氮含量，最终增加了甘蔗生物量[10-11]。我们的结果显示，粤糖93-159和ROC22根系和+4叶中的固氮酶活性在不施氮肥条件下均较高(图3)，说明缺氮促进了甘蔗联合固氮细菌的定殖，进而使甘蔗叶片氮浓度在不施氮肥条件下最高(图2A)。Panwar和Singh[20]发现，小麦接种固氮螺菌促进了根系生长，进而促进了对其他土壤矿质养分的吸收；在甘蔗中分离的大部分内生固氮菌，具有合成分泌 IAA、嗜铁素和溶解无机磷等特性[21]。这暗示了，充分发挥联合固氮作用对提高甘蔗营养高效的重要性。因此，本研究在不施氮肥条件下，甘蔗叶片的P和K浓度均比其他处理高。说明，充分发挥甘蔗联合固氮作用不仅能增加植株对N的获取，同时是提高甘蔗养分高效的重要策略，甘蔗的联合固氮系统与土壤矿质养分息息相关。粤糖93-159和ROC22在不同施肥条件下，各有优势。例如，ROC22的株高在本研究所设置的处理中均明显高于粤糖93-159，而有效茎数表现出相反的结果；2个品种的固氮酶活性在不同施肥条件下也存在差异，研究结果可为甘蔗内生固氮菌与矿质养分的关系以及品种差异(选择优势品种) 的研究提供一定理论依据。

因此，通过研究结果表明：氮、磷、钾是甘蔗与固氮微生物联合固氮系统形成的重要调控因素。不施氮肥显著抑制了甘蔗的生长发育，甘蔗株高、茎径和有效茎数，但促进了甘蔗联合固氮作用，显著提高了根系和+4叶的固氮酶活性。不施磷肥显著减少了甘蔗的有效茎数，并影响甘蔗的固氮酶活性和氮营养。

图3 不同施肥处理对不同甘蔗品种根和叶固氮酶活性的影响