刺梨叶质量标准研究*

王媛媛 ，雷 艳 ，马 雪 ，刘春花 ，黄 勇 ，王爱民 ，李勇军 △

（1.贵州科顿制药有限责任公司，贵州 贵阳 550002； 2.贵州医科大学民族药与中药开发应用教育部工程研究中心，贵州 贵阳 550004； 3.贵州医科大学药学院，贵州 贵阳 550004； 4.贵州医科大学贵州省药物制剂重点实验室，贵州 贵阳 550004）

刺梨叶又称缫丝花叶，为蔷薇科植物缫丝花Rosa roxburghiiTratt.及单瓣缫丝花Rosa roxburghiiTratt.f.normalis Rehd.et Wils.的干燥叶，收载于2003年版《贵州省中药材、民族药材质量标准》（以下简称《标准》）[1]，其味甘、酸涩，归脾、肾、胃经，用于治疗积食饱胀、疥痛金疮，是小儿消食开胃颗粒的主要药材[2-4]，主要分布于贵州，四川、陕西、甘肃等地亦产[5]。目前，关于刺梨的研究报道较多[6-11]，但刺梨叶的研究报道较少，且主要集中于化学成分分离和药理活性研究[12-13]，对刺梨叶的质量标准研究尚未见报道，《标准》中也仅见性状描述、简单显色反应及薄层色谱鉴别试验。本研究中参考文献[14-15]，重新建立了刺梨叶薄层色谱鉴别方法，并对相关项目进行检查，采用高效液相色谱（HPLC）法测定了刺梨叶中水解没食子酸含量，可有效控制刺梨叶药材的质量。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Camag Reprostar 3型薄层数码成像系统（瑞士卡玛公司）；EL204型电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）；CQ-250A-ST型超声波清洗机（上海跃进医用光学器械厂）；WP-UP-Ⅱ-20型超纯水机（四川沃特尔科技发展有限公司）；UltiMate 3000型高效液相色谱仪（包括系统控制器、输液泵、脱气组件、低压梯度组件、自动进样器、柱温箱、温控样品室、ΜV-VIS检测器及Chromeleon色谱数据工作站）；Allegra64R型台式冷冻离心机（美国贝克曼公司）。

1.2 试药

刺梨叶对照药材（批号为121355-200401）、没食子酸对照品（批号为110831-200302）均购于中国食品药品检定研究院；薄层色谱硅胶板G（青岛海洋化工有限公司）；甲醇为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯；刺梨叶药材共7批，样品为贵州不同地区采收的4批药材和收购的3批药材样品，由贵阳中医学院药学院生药实验室孙庆文教授鉴定为蔷薇科植物缫丝花Rosa roxburghiiTratt.的干燥叶，具体采收地见表1。

表1 刺梨叶药材信息

2 方法与结果

2.1 薄层色谱鉴别

取样品粉末0.2g，加无水乙醇15mL，超声处理10min，滤过，滤液蒸干，残渣加无水乙醇1 mL使其溶解，作为供试品溶液。另取刺梨叶对照药材0.2 g，同法制成对照药材溶液。照2015年版《中国药典（四部）》通则0502薄层色谱法试验，吸取上述溶液各3 μL，分别点于同一硅胶 G板上，以石油醚-丙酮（3∶1，V∶V）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%磷钼酸乙醇溶液，于105℃加热至斑点显色清晰。供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液色谱相应位置上显相同颜色的斑点，详见图1。

图1 薄层色谱图

2.2 相关项目检查

照2015年版《中国药典（四部）》通则0832第二法中水分测定法、通则2302中总灰分测定法、通则 2201中的醇溶性浸出物测定法项下热浸法测定7批刺梨叶药材的水分、总灰分及浸出物，结果见表2。暂定本品水分不超过12.0%，总灰分不超过9.0%，乙醇浸出物不少于15.0%。

表2 刺梨叶水分、总灰分及浸出物测定结果（%，n=7）

2.3 没食子酸含量测定

2.3.1 色谱条件及系统适用性试验

色谱柱：Venusil XBP C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇 -0.5%醋酸溶液（3 ∶97，V∶V）；流速：1 mL/min；柱温：25 ℃；检测波长：270 nm；进样量：10 μL。在此色谱条件下，样品中其他成分与没食子酸分离度良好，色谱图见图2。

图2 高效液相色谱图

2.3.2 溶液制备

取刺梨叶药材粉末（过3号筛）约0.25 g，精密称定，精密加入10%盐酸25 mL，称定质量，加热回流1 h，放冷，再称定质量，用10%盐酸补足减失的质量，摇匀，滤过，精密吸取续滤液5 mL，以水稀释至25 mL，离心，去上清液，即得供试品溶液。取没食子酸对照品适量，精密称定，加30%甲醇溶解，制成每1 mL含没食子酸0.526 mg的溶液，摇匀，即得对照品贮备液，精密量取适量，配制成质量浓度为52.60 μg/mL的对照品溶液。

2.3.3 方法学考察

线性关系考察：分别精密量取对照品贮备液适量，置10 mL容量瓶中，用30%甲醇定容，配制成质量浓度分别为 5.26，26.30，52.60，78.90，99.40 μg/mL 的系列对照品溶液，依法进样，测定峰面积，以对照品溶液质量浓度（X，μg/mL）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程Y=0.481 1X-0.206 4，r=0.999 9（n=5）。结果表明，没食子酸质量浓度在5.26～99.40μg/mL范围内与峰面积线性关系良好。

中间精密度试验：以不同的试验人，在不同时间分别取同一批药材（批号为20160824）粉末各0.25 g，精密称定，制备供试品溶液，分别进样，测定峰面积。结果的RSD为0.66%（n=6），表明中间精密度良好。

重复性试验：分别取同一批刺梨叶药材（批号为20160824）粉末 0.125，0.25，0.50 g各 3 份，精密称定，制备供试品溶液，分别进样，测定峰面积。结果的RSD为1.21%（n=9），表明方法重复性良好。

稳定性试验：精密吸取同一供试品溶液10 μL，按拟订色谱条件分别于 0，1，2，4，8，24 h 时进样测定峰面积。结果的RSD为1.33%（n=6），表明供试品溶液在24 h内稳定。

加样回收试验：分别取已知含量的6份同一批样品（批号为20160824）粉末各0.25 g，精密加入没食子酸对照品，分别进样测定，计算回收率。结果见表3。

表3 没食子酸加样回收试验结果（n=6）

2.3.4 样品含量测定

精密称取7批刺梨叶药材（批号分别为20170901，20170806，20161011，20160825，20160824，20160817，20160816）适量，按拟订方法制备供试品溶液，依法测定没食子酸含量。结果7批样品中没食子酸的含量分别为0.85% ，1.26% ，0.97% ，0.91% ，1.53% ，1.04% ，0.86%，平均含量为1.06%。暂定刺梨叶药材没食子酸含量不得少于0.80%。

3 讨论

分别考察了以氯仿-甲醇-甲酸（7∶1∶0.1，V∶V）、氯仿 -乙酸乙酯（50∶1，V∶V）和石油醚 -丙酮（3∶1，V∶V）为展开剂，5%磷钼酸乙醇溶液显色，于105℃加热至斑点显色清晰，试验结果表明，以石油醚-丙酮（3∶1，V∶V）为展开剂的分离度良好，Rf值适中，显色清晰，故选择石油醚 -丙酮（3∶1，V∶V）为展开剂。

分别以8%盐酸、10%盐酸、12%盐酸为提取溶剂进行考察，分别加热回流提取1.0 h，结果表明，10%盐酸对没食子酸提取率最高，故选择10%盐酸作为提取溶剂。以10%盐酸作为提取溶剂，分别加热回流提取0.5，1.0，2.0 h，结果提取时间为1.0 h时没食子酸已提取完全，当提取时间继续增加时，提取率不再增加，因此确定提取时间为1.0 h。

分别考察了不同色谱柱，ODS-3柱（250mm×4.6mm，5 μm），Venusil XBP C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm），Luna C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；不同流速，如0.90 mL/min，1.0 mL/min，1.1 mL/min；不同柱温，如22，25，28℃。结果显示，在上述条件下，供试品溶液中，在与对照品溶液相同时间的出峰一致，综合考虑分离度、理论板数及出峰时间等因素的影响，发现以甲醇-0.5%醋酸溶液（3∶97，V∶V）为流动相，柱温为 25℃时，没食子酸与其他组分的分离度良好。另外，在测定没食子酸的紫外吸收光谱图时发现，在270 nm波长处有最大吸收，故以此为检测波长。