QuEChERS前处理结合高效液相色谱-串联质谱法 同时测定酵母产品中4种抗氧化剂和5种防腐剂

李艳美，李芳,，粟有志,，周均,，罗琼，王静文，王兴磊*

1(伊犁师范大学，污染物化学与环境治理重点实验室，新疆 伊宁，835000) 2(伊宁海关技术中心，新疆 伊宁，835000)

酵母产品是指酵母菌以糖类、粮食为原料，添加需要的营养素，利用相关生物技术和发酵工艺，获得营养丰富的酵母制品或酵母衍生制品，广泛应用于食品、保健品、生物制药、酿造发酵、生物化工、石油及农畜牧业等领域[1]。为提高酵母产品稳定性，在生产工艺中加入抗氧化剂和防腐剂[2]。

食品用防腐剂和抗氧化剂可以分为复合型、天然及化学合成[3]，也可根据其起源和化学结构进行分类。化学合成抗氧化剂和防腐剂使用简单有效而应用广泛[4]。但其对人体心肝脾胃肾等脏器产生一定的危害[5]，欧盟等大多数国家的法规中都对其有严格的限量。中国GB 2760—2014也规定了最大使用限量。

检测防腐剂和抗氧化剂的仪器方法有示波极谱法[6]、紫外分光光度法[7]、胶束电动色谱法[8]、薄层色谱法[9]、离子色谱[10]、毛细管电泳技术[11]、流动注射化学发光法[12]、红外光谱法、比值导数波谱法[13]等，以上检测方法只适用于特定的样品基质，且可检测的防腐剂、抗氧化剂的品种有限。大部分防腐剂和抗氧化剂均是极性化合物到中等极性化合物，常用的检测方法为液相色谱(high performance liquid chromatography，HPLC)[14-15]、气相色谱(gas chromatography，GC)[16-17]、气相质谱联用仪(gas chromatography-mass，GC-MS)[18-20]、液相质谱联用仪(liquid chromatography-mass,LC-MS)[21-23]等技术。而液相和气相色谱法为半定性，气相质谱法提取时需要大量的有机溶剂；液相质谱法检测准确性好，灵敏度高。

酵母产品基质复杂，前处理需要有效去除基质干扰，降低杂质对目标化合物的影响，本文采用试剂耗材消耗少，步骤简单、高效、安全的QuEChERS样品前处理技术[14，24-26]，结合高效液相色谱-串联质谱法确证法，建立检测酵母产品中4种抗氧化剂和5种对羟基苯甲酸酯类防腐剂的方法。该方法准确、可靠、快速、高效，为酵母产品中4种抗氧化剂和5种对羟基苯甲酸酯类防腐剂的检测提供了实用的技术手段，对监测酵母产品中添加剂的使用情况具有现实意义。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

1260-6460A HPLC-ESI-MS/MS高效液相色谱-串联质谱仪(配有自动进样器、四元泵、电喷雾离子源、色谱质谱工作站)，美国安捷伦科技公司；miIIi-Q advangtage A10超纯水系统，Millipore公司；Sigma3-18K台式冷冻离心机，Sigma公司；ME104E电子天平(万分之一 天平120 g/0.1 mg)，梅特勒托利多公司；SK8210LHC超声波清洗器，上海科导超声仪器有限公司；N-EVAP-112 水浴氮吹仪，美国Organomation公司；MS3型涡旋振荡器，德国IKA公司。

乙腈、甲醇、丙酮、甲酸、乙醇和正己烷均为色谱纯，德国MERCK公司；冰乙酸(优级纯)、乙酸铵(优级纯)，成都市科龙化工试剂厂；NaCl(99.8%),天津市光复科技发展有限公司；试验用水为Milli-Q超纯水(符合GB/T 6682—2008一级水要求)；酸性氧化铝(ALA)，北京振翔公司；硫酸化聚苯乙烯/二乙烯苯(PCX)、C18粉、N-丙基乙二胺(PSA)、聚苯乙烯/二乙烯苯(PEP)、石墨化炭黑(GCB)、氨基(-NH2)，均购自天津博纳艾杰尔科技有限公司；4种抗氧化剂和5种对羟基苯甲酸酯类防腐剂标准品信息详见表1；分析样品为实验室送检和市售样品。

表1 四种抗氧化剂和5种对羟基苯甲酸酯类防腐剂标准品信息Table 1 The notice for the four antioxidants and five p-hydroxybenzoate antiseptics

1.2 标准溶液的配制

添加剂标准储备溶液：准确称取标准品10 mg(精确至0.01 mg)于10 mL容量瓶中，用甲醇超声溶解摇匀稀释至刻度，配成质量浓度为1 g/L的标准储备液。考虑称样量乘以纯度后除以体积，配置后各添加剂的最终质量浓度如下(mg/L)：EPB 999；PP 985.05；MPB 969.03；MPB 993.60，BP 980.10；BHA 968.24；Ionox-100 985.0；HR 975.0，EQ 978.04。储存于4 ℃冰箱中备用。

中间混合标准溶液：根据每种添加剂在仪器上的响应灵敏度，确定其在混合标准溶液中的浓度，用水稀释添加剂标准储备溶液至中间混合标准溶液100 mg/L。

1.3 样品前处理

称取2 g样品(精确至0.01 g)于50 mL具塞离心管，加入10 mL水，加入5 mL乙腈饱和的正己烷，涡旋振荡超声3 min。加入10 mL正己烷饱和的乙腈，2 500 r/min充分涡旋振荡3 min，加入2 g NaCl，涡旋振荡3 min后超声5 min。10 000 r/min离心5 min， 取乙腈层5 mL于15 mL具塞离心管，40 ℃水浴氮吹至干后用流动相(V(10 mmol/L乙酸铵)∶V(甲醇)=1∶1)1 mL振荡超声溶解，加入100 mg C18后充分振荡，8 000 r/min离心10 min。上清液过0.22 μm针头式滤膜至进样小瓶，供HPLC-ESI-MS/MS测定。

1.4 LC-MS/MS条件

色谱条件：JADE-PAK C18柱(2.1 mm×100 mm, 3 μm)；柱温：30 ℃；进样量：10.0 μL；流速为0.2 mL/min；流动相：A相为10 mmol/L乙酸铵溶液，B相为甲醇，梯度洗脱程序如表2。

表2 流动洗脱程序Table 2 Flow elution program

质谱条件：离子源：电喷雾离子源(ESI)；扫描方式：防腐剂EQ正离子扫描，其他防腐剂为负离子扫描；检测方式：多重反应监测(MRM)；雾化气、鞘气、碰撞气均为高纯氮气；安装有雾化器垫片；雾化气压力：275.8 kPa；干燥气流速：10 L/min；干燥气温度：350 ℃； 鞘气流速：11.0 L/min，鞘气温度：250 ℃；毛细管电压:3 500 V；监测离子对、碰撞能力、碎裂电压等参见表3。

表3 四种抗氧化剂和5种对羟基苯甲酸酯类防腐剂的质谱分析参数Table 3 The mass parameters for the 4 antioxidants and 5 p-hydroxybenzoate antiseptics

注：*表示定量离子。

2 结果与分析

2.1 仪器条件的优化

2.1.1 质谱参数的优化

根据4种抗氧化剂和5种对羟基苯甲酸酯类防腐剂本身的电离性质，配制单一标准溶液，在不接色谱柱，接入两通的条件下，分别用正离子扫描模式和负离子扫描模式进行母离子全扫描。

利用Mass Hunter Optimizer软件，在MRM模式下，对4种抗氧化剂和5种对羟基苯甲酸酯类防腐剂的母离子、碎裂电压、子离子、碰撞能量等参数进行进一步的优化，获得最佳的质谱参数条件。

4种抗氧化剂和5种对羟基苯甲酸酯类防腐剂二级质谱图见图1。

图1 四种抗氧化剂和5种防腐剂的二级质谱图Fig.1 MS-MS spectra of four antioxidants and five p-hydroxybenzoate antiseptics

参照欧盟指令657/2002/EEC中有关规定，选择本底干扰最小、离子丰度最高的两个离子对作为特征离子对，其中选择丰度比较大的离子作为定量离子，另一个信号较大的离子对作为定性离子对。4种抗氧化剂和5种对羟基苯甲酸酯类防腐剂的定量离子和定性离子对及其他质谱分析参数详见表3。

2.1.2 流动相的优化

采用液相色谱-质谱分析样品时，流动相体系中有机相一般以乙腈、甲醇为主，水相中适当添加一定量的缓冲物质。缓冲盐溶液尽可能不要用于液相色谱-质谱的流动相，因其会污染离子源，使质谱灵敏度下降。本章的无机相由不同比例的甲酸水、乙酸铵水、甲酸-乙酸铵水溶液组成，有机相由乙腈和甲醇组成，研究比较不同流动相的分离效果。图2为不同流动相下9种分析物的总体响应值比较，结果表明，甲醇-10 mmol/L乙酸铵水溶液为流动相时，各添加剂的响应值较高，通过设定梯度洗脱程序，4种抗氧化剂和5种对羟基苯甲酸酯类防腐剂基线分离，可在15 min内完成测试。

图2 不同流动相下9种分析物的总体响应值比较Fig.2 Comparison of response values of 9 analytes in different mobile phase

2.2 前处理条件的优化

2.2.1 提取溶剂的选择

本试验中的添加剂易溶于乙腈、甲醇、乙醇等溶剂，实验比较7种不同的提取实验方案来比较确定最优提取剂，比较了甲醇、乙醇、乙腈、甲醇-乙醇(体积比5∶5)、甲醇-乙腈(体积比5∶5)、乙醇-乙腈(体积比5∶5)、正己烷饱和乙腈的提取效果。从图3不同提取溶剂对4种抗氧化剂和5种对羟基苯甲酸酯类防腐剂的提取回收率可以看出，甲醇、乙醇、乙腈、甲醇-乙醇(体积比5∶5)、甲醇-乙腈(体积比5∶5)、乙醇-乙腈(体积比5∶5)提取时大部分防腐剂的回收率低于60%，达不到检测要求；用纯乙腈提取时，虽然提取回收率为86%～123%，但提取上机后基质影响比较大；在提取之前先用乙腈饱和的正己烷溶解，降低溶液的黏度，再用正己烷饱和的乙腈进行提取时4种抗氧化剂和5种对羟基苯甲酸酯类防腐剂的提取回收率为89.8%～122%，回收率满足检测要求。

图3 不同提取剂下9种分析物的回收率Fig.3 Recovery of 9 analytes from different extraction agents

2.2.2 净化剂的选择

为选取实验前处理所用最为适宜的净化剂，本实验比较了酸性氧化铝(ALA)、硫酸化聚苯乙烯/二乙烯苯(PCX)、C18粉、N-丙基乙二胺(PSA)、聚苯乙烯/二乙烯苯(PEP)、石墨化炭黑(GCB)、氨基(-NH2)7种吸附剂对样品的净化效果来进行吸附实验。实验中PCX对EPB和PP有吸附，回收率仅为38%～55%；PSA对于Ionox-100回收率为55%左右；SPE对于大部分对羟基苯甲酸类防腐剂的回收率约为65%；-NH2做吸附剂时对EPB有吸附，Al2O3对Ionox-100和HR的回收率达不到检测要求；PEP对4种抗氧化剂和5种对羟基苯甲酸酯类防腐剂回收率为75%；这7种净化剂中只有C18对4种抗氧化剂和5种对羟基苯甲酸酯类防腐剂都不吸附，回收率为97%～108%。所以选择C18可以作为实验的净化剂。酵母抽提物样品中不同净化剂对4种抗氧化剂和5种对羟基苯甲酸酯类防腐剂的回收率效果见图4。

图4 不同净化剂下4种抗氧化剂和5种对羟基苯甲酸酯类防腐剂的净化回收率Fig.4 Purification and recovery rate of the four antioxidants and five p-hydroxybenzoate antiseptics under different purification agents

2.2.3 净化剂使用量的选择

净化剂C18用量的优化：实验加入C18的量分别为25、50、100、150、200、300 mg。酵母产品中C18加入不同量时对4种抗氧化剂和5种对羟基苯甲酸酯类防腐剂的回收率效果发现，加入量为25和50 mg时净杂质峰去除不明显，当加入至100 mg时，基线明显平稳，加入量为150、200、300 mg时与加入100 mg时吸附杂质效果相当。最终选择的净化剂用量为100 mg。

2.3 线性范围、检出限和定量限

经过高效液相色谱-串联质谱仪，以选择离子监测模式扫描进行分析测定，以防腐剂的浓度为横坐标(x)，特征碎片离子的峰面积为纵坐标(y)，作线性回归，绘制标准曲线，4种抗氧化剂和5种对羟基苯甲酸酯类防腐剂在0.1～10 mg/L的相关系数(r2)均大于0.992。空白样品按照2.2.1节方法前处理样品，以信噪比(S/N)≥3时确定方法的检出限(limits of detection,LOD)，其范围为0.03～0.15 mg/kg；以S/N≥10确定方法的定量限(limits of quantification,LOQ)，为0.10～0.5 mg/kg。4种抗氧化剂和5种对羟基苯甲酸酯类防腐剂的线性方程、相关系数、检出限和定量限详见表4。

表4 四种抗氧化剂和5种对羟基苯甲酸酯类防腐剂的线性方程、检出限和定量限Table 4 Regression equation, correlation coefficient, limits of detection, limits of quantification of four antioxidants and five p-hydroxybenzoate antiseptics

2.4 方法的准确度和精密度

以活性干酵母和酵母抽提物阴性样品为空白，以1、3、10 倍LOQ为加标水平进行回收率实验。添加了防腐剂在酵母产品中混合标准溶液的样品，按照1.2节方法和仪器条件进行前处理和仪器测定，每个水平重复6次。回收率和相对标准偏差见表5。活性干酵母中4种抗氧化剂和5种对羟基苯甲酸酯类防腐剂的回收率在78.9%～108.6%，相对标准偏差4.2%～15.8%； 酵母抽提物中4种抗氧化剂和5种对羟基苯甲酸酯类防腐剂的回收率在82.9%～107.4%，相对标准偏差4.7%～14.5%，表明该方法的准确度高，通用性好。

2.5 实际样品测定

应用本方法对36批活性干酵母和28份酵母抽提物中 4种抗氧化剂和5种对羟基苯甲酸酯类防腐剂进行分析，在这些样品中均未检出，应用本方法能有效降低基质干扰，加标回收率良好，满足实际样品分析的要求。

表5 不同酵母产品中4种抗氧化剂和5种对羟基苯甲酸酯类 防腐剂的回收率和相对标准偏差(n=6)Table 5 Recoveries and RSDs of four antioxidants and five p-hydroxybenzoate antiseptics by standard addition method with yeast products

续表5

抗氧化剂加标水平/(mg·kg-1)活性干酵母酵母抽提物回收率/%RSDs/%回收率/%RSDs/%0.2092.312.388.810.3BHA0.60106.410.2105.112.42.0095.48.287.78.20.1086.49.982.95.9Ionox-1000.30103.612.198.610.51.0094.710.095.413.10.5095.214.186.89.1HR1.00101.66.390.85.05.0093.84.295.34.70.1082.58.8102.56.4EQ0.3081.511.198.37.81.0096.910.5106.65.6

3 结论

本章研究建立了以正己烷饱和的乙腈为提取剂，经QuEChERS前处理，C18净化，酵母粉和酵母抽提物中对羟基苯甲酸乙酯(EPB)、对羟基苯甲酸丙酯(PP)、对羟基苯甲酸甲酯(MPB)、对羟基苯甲酸正丁酯(BP)、叔丁基对羟基苯甲醚(BHA)、2,6-二叔丁基-4-羟甲基苯酚(Ionox-100)、4-正己基间苯二酚(HR)乙氧喹啉(EQ)共计4种抗氧化剂和5种对羟基苯甲酸酯类防腐剂的高效液相色谱-串联质谱检测方法，在0.1～10 mg/L相关系数(r2)均大于0.992，3个加标水平(1、3、10倍定量限)下，活性干酵母中的回收率78.9%～108.6%，相对标准偏差4.2%～15.8%；酵母抽提物中的回收率82.9%～107.4%，相对标准偏差4.7%～14.5%。 该方法快速简便、准确可靠，精密度好、回收率高，方法可以满足实验室高通量复酵母产品中4种抗氧化剂和5种对羟基苯甲酸酯类防腐剂的检测需求。可为酵母产品中此类物质的检测提供可靠的技术支持，为建立行业标准奠定基础。