超声均质法制备以乳清蛋白-OSA变性淀粉为乳化剂的纳米乳液

杨贵妃，杨柳，钟金锋，覃小丽

(西南大学 食品科学学院，食品科学与工程国家级实验教学示范中心，重庆，400715)

目前，在食品领域，水包油型纳米乳液主要用于包埋脂溶性功能物质，构建功能成分运输载体，解决某些脂溶性功能物质水溶性差、生物利用率低等问题[1]。在纳米乳液的制备过程中，常添加一些两亲性物质，使其吸附在油/水界面，通过静电排斥或空间位阻效应维持纳米乳液的稳定性[2]。乳清蛋白主要由β-乳球蛋白组成，具有营养价值高、易于消化吸收等特点[3]，是制备纳米乳液常用的乳化剂之一。但以乳清蛋白为单一类型乳化剂制备的纳米乳液，在蛋白质等电点(pI ≈ 4.5)容易发生聚沉和絮凝，容易受到离子等条件的影响[4]，限制其在食品加工中的广泛应用。因此，在以蛋白质为乳化剂的乳液中常添加一些多糖物质，利用多糖的空间位阻效应和黏度增加乳液的稳定性[5]。

目前，蛋白质乳液中常添加的多糖有果胶[6-7]、黄原胶[7-8]和大豆多糖[9]等。NEIRYNCK等[6]制备了pH=5.5的β-乳球蛋白乳液，发现在相同条件下β-乳球蛋白-果胶乳液更加稳定。因为果胶吸附在液滴界面引起静电排斥作用增加，使乳液粒径减小，并且通过显微镜观察到乳液絮凝现象减少。QIU等[7]研究发现，与小麦蛋白乳液相比，在pH=3.5或5下小麦蛋白-黄原胶乳液能有效减少液滴在小麦蛋白等电点(pI=5)附近的聚集，明显改善了该乳液在0.1 mol/L NaCl和0.02 mol/L CaCl2下的稳定性，并且在储存4周内未观察到相分离现象。辛烯基琥珀酸酯淀粉(octenyl succinic anhydride modified starch，OSA变性淀粉)是一种被FDA和GRAS认证的安全多糖，在食品中常作为乳化剂、稳定剂、增稠剂等，具有可降解、来源广泛、廉价易获取[10]等特点。TESCH等[11]发现OSA变性淀粉主要利用其多分支结构形成的空间位阻稳定液滴，其粒径大小不受pH和离子价的影响，OSA变性淀粉在蛋白质等电点附近作为乳化剂具有明显优势。然而，OSA变性淀粉与蛋白质组合用于纳米乳液制备的研究报道有限，添加OSA变性淀粉对蛋白质乳液稳定性的影响尚不清楚。

因此，拟以乳清蛋白-OSA变性淀粉组合制备纳米乳液，探究乳清蛋白与OSA变性淀粉质量比和质量分数、超声时间和功率等对纳米乳液形成与稳定的影响；此外，研究不同环境因素(pH、Na+、Ca2+、温度)下，添加OSA变性淀粉对乳清蛋白纳米乳液稳定性的影响，为乳清蛋白-OSA变性淀粉纳米乳液在食品领域的应用提供一定借鉴。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

乳清蛋白(CAS#9006-59-1，纯度为80%)，合肥博美生物科技有限责任公司；辛烯基琥珀酸酯淀粉(HI-CAP100)，阿泽雷斯国际贸易(上海)有限公司；大豆油，益海嘉里食品营销有限公司；超纯水，YSL-RO-T10L/H超纯水系统(Ashland公司)制备。

1.2 仪器与设备

DF-101S型集热式恒温加热磁力搅拌器，巩义市予华仪器有限责任公司；T18 ULTRA-TURRAX型高速均质机，德国IKA公司；JY98-IIIDN型超声波细胞粉碎机，宁波新芝生物科技股份有限公司；Zetasizer NS90型激光粒径仪，英国Malvern公司。

1.3 试验方法

1.3.1 纳米乳液的制备方法

将一定质量的乳清蛋白溶于0.01 mol/L的磷酸盐缓冲液(pH=7)中，水浴搅拌2 h(30 ℃，500 r/min)后，滴加叠氮化钠(使最终质量分数为0.02%)以抑制微生物的生长，将乳清蛋白溶液于4 ℃静置11 h，使乳清蛋白充分溶胀。称取一定质量OSA变性淀粉溶于乳清蛋白溶液中，水浴搅拌40 min(30 ℃，500 r/min)，得到水相。使用恒压漏斗向水浴搅拌(30 ℃，500 r/min)的大豆油中滴加水相，滴加完后搅拌10 min。对上述得到的油水混合物进行均质(20 000 r/min，3 min)、超声处理(通过冰水浴控制温度不超过45 ℃)，得到纳米乳液。

1.3.2 单因素试验

按照1.3.1的方法制备纳米乳液，以纳米乳液的粒径、多分散系数(polydispersity index，PDI)和外观变化现象为评价指标，优化乳清蛋白与OSA变性淀粉质量比(0∶10、3∶7、5∶5、7∶3、10∶0)、乳化剂质量分数(1%～9%)、油相质量分数(1%～7%)、超声时间(3～28 min)和超声功率(120～600 W)这5个影响纳米乳液制备的主要因素。

1.3.3 稳定性试验

根据单因素试验优化条件(乳清蛋白-OSA变性淀粉质量比3∶7、乳化剂质量分数5%、油相质量分数1%、超声时间23 min和超声功率360 W)制备纳米乳液备用，同时制备乳清蛋白纳米乳液(乳清蛋白-OSA变性淀粉质量比10∶0、乳化剂质量分数5%、油相质量分数1%、超声时间23 min和超声功率360 W) 作对比，考察环境因素对乳清蛋白-OSA变性淀粉纳米乳液稳定性的影响。

不同环境因素的控制：用1 mol/L的HCl和NaOH溶液调节纳米乳液的pH(3～9)；用5 mol/L的NaCl溶液调节纳米乳液中的钠离子浓度(0～1.0 mol/L)；用3 mol/L的CaCl2溶液调节纳米乳液中的钙离子浓度(0～0.032 mol/L)；将纳米乳液置于不同温度(40～90 ℃)的水浴中保温20 min，迅速冷却至室温。定期取样测定各组纳米乳液的粒径，并观察外观变化。

1.4 粒径和PDI的测定

为了尽量降低多重光散射效应，用超纯水将待测纳米乳液稀释1 000倍，使用Zetasizer NS90型激光粒径仪测定纳米乳液的粒径和PDI。测定温度为25 ℃， 平衡时间为120 s，每个样品平行测定2组，每组测定3次，每次测定值为13个子测试结果的平均值。

1.5 数据处理

每组试验至少重复2次，每个样品的各指标至少平行测定3次，结果以平均值±标准偏差表示。使用SPSS 18.0软件对数据进行单因素方差分析(P<0.05时判断组间存在显著差异)，用Origin 8.0软件绘图。

2 结果与分析

2.1 乳清蛋白-OSA变性淀粉纳米乳液的制备

2.1.1 乳清蛋白与OSA变性淀粉质量比对纳米乳液的形成和稳定的影响

本环节固定乳化剂总质量分数为7%，油相质量分数为4%，超声时间8 min，超声功率360 W，考察乳清蛋白与OSA变性淀粉的质量比对纳米乳液稳定性的影响。乳清蛋白与OSA变性淀粉质量比从10∶0变化到3∶7的过程中，纳米乳液的粒径显著增加(P<0.05)了70.27 nm(图1)，说明在乳清蛋白-OSA变性淀粉纳米乳液中，随着蛋白质比例的减小，纳米乳液的粒径不断增大。质量比为3∶7的纳米乳液的粒径和PDI均达到最大，分别为303 nm和0.23(图1)，这可能是因为此时纳米乳液的pH接近乳清蛋白等电点(表1)，乳清蛋白溶解度降低，乳化能力减弱，从而使纳米乳液的稳定性降低。

图1 乳清蛋白-OSA变性淀粉质量比对纳米乳液的形成和稳定的影响Fig.1 Effect of whey protein-OSA modified starch weight ratio on the formation and stabilization of nanoemulsions

质量比从3∶7变化到0∶10，纳米乳液的粒径显著减小(P<0.05)了61.97 nm，说明单独使用OSA变性淀粉能形成粒径较小的纳米乳液。在乳清蛋白-OSA变性淀粉纳米乳液中，质量比为7∶3的纳米乳液粒径最小(244 nm)，并且在测定时间内，乳液粒径基本不变。为进一步研究其他因素对乳清蛋白-OSA变性淀粉纳米乳液稳定性的影响，选取乳清蛋白-OSA变性淀粉质量比为7∶3。

表1 不同乳清蛋白-OSA变性淀粉质量比 下水相和纳米乳液的pHTable 1 The pH of aqueous phase and nanoemulsions in different whey protein-OSA modified starch weight ratios

2.1.2 乳化剂质量分数对纳米乳液的形成和稳定的影响

本环节固定乳清蛋白与OSA变性淀粉质量比为7∶3，油相质量分数为4%，超声时间8 min，超声功率360 W，考察乳化剂质量分数对纳米乳液稳定性的影响。随着乳化剂质量分数从1%增加到5%，纳米乳液的粒径从310 nm减小到255 nm，PDI从0.32减小到0.19；乳化剂质量分数大于5%时，纳米乳液的粒径和PDI分别维持在250 nm和0.16左右，乳化剂质量分数对粒径和PDI变化无显著(P>0.05)影响(图2)。

图2 乳化剂质量分数对纳米乳液的形成和稳定的影响Fig.2 Effect of the mass fractin of the emulsifier on the formation and stabilization of nanoemulsions

这些结果表明，用于形成乳清蛋白-OSA变性淀粉纳米乳液的乳化剂存在临界浓度。当乳化剂质量分数小于5%时，纳米乳液表面在52 h出现白色薄层絮状物，这可能是因为纳米乳液液滴界面未被乳化剂饱和，从而发生了液滴的絮凝[12]。在5%的乳化剂质量分数下，纳米乳液粒径较小，分布比较均一。因此，5%的乳化剂制备的纳米乳液具有较好的稳定性，此时纳米乳液中液滴周围的界面膜可能基本被乳化剂所覆盖[13]。乳化剂质量分数大于5%时，纳米乳液粒径呈减小趋势，但变化不显著。因此选取乳化剂质量分数为5%。

2.1.3 油相质量分数对纳米乳液的形成和稳定的影响

本环节固定乳清蛋白与OSA变性淀粉质量比为7∶3，乳化剂质量分数为5%，超声时间8 min，超声功率360 W，考察油相质量分数对纳米乳液稳定性的影响。随着油相质量分数从1%增加到7%，纳米乳液的粒径和PDI分别显著(P<0.05)增加了89 nm和0.05(图3)。

图3 油相质量分数对纳米乳液的形成和稳定的影响Fig.3 Effect of the mass fraction of oil phase on the formation and stabilization of nanoemulsions

在所研究的范围内，油相质量浓度为7%的纳米乳液粒径和PDI最大，并且在27 h时，纳米乳液表面产生白色薄层絮状物。这可能是因为此时乳化剂不足以在大量的油滴表面形成致密的吸附层，反而可能充当油滴之间的桥梁从而导致液滴絮凝[14-15]。此外，随着油相质量分数的增加，油滴之间碰撞的频率可能不断提高，使乳液液滴更易发生絮凝。当油相质量分数为1%时，纳米乳液的粒径和PDI均为最小，说明此时乳化剂能在液滴界面形成较好的吸附层，从而维持纳米乳液的稳定性。因此选取油相质量分数为1%。

2.1.4 超声时间对纳米乳液的形成和稳定的影响

超声波技术是目前制备食品级纳米乳液的新技术之一，制备的纳米乳液具有粒径小、稳定性高、乳化剂使用量少、高效环保等特点[16-17]。本环节控制乳清蛋白与OSA变性淀粉质量比为7∶3，乳化剂质量分数为5%，油相质量分数为1%，超声功率360 W，考察超声时间对纳米乳液稳定性的影响。超声时间从3 min增加到28 min，纳米乳液粒径和PDI呈现先快速减小后缓慢减小的趋势(图4)，说明进行一定时间的超声处理可以改善纳米乳液的稳定性和分散状态。超声时间为3、8 min的纳米乳液粒径(> 208 nm)较大，并且在76 h时乳液表面产生白色薄层絮凝物，说明其稳定性相对较差。超声时间从13 min增加到28 min，纳米乳液粒径从197 nm逐渐减小到172 nm，PDI值基本保持不变(图4)。

图4 超声时间对纳米乳液的形成和稳定的影响Fig.4 Effect of ultrasonic time on the formation and stabilization of nanoemulsions

在所研究的范围内，超声时间越长，纳米乳液的粒径越小，在室温下保持稳定的时间越长。原因可能是超声波产生的物理效应破坏了乳清蛋白分子间的相互作用，使原来在乳清蛋白内部的疏水基团暴露在乳清蛋白表面，从而增加乳清蛋白的表面疏水性[18]，降低了乳清蛋白的界面张力，进而使乳清蛋白在油/水界面处的迁移速率加快，形成致密的界面膜。此外，JAMBRAK等[19]对乳清蛋白进行超声处理，发现超声处理后乳清蛋白的粒径和分子质量均显著减小，增加了乳清蛋白及其水解物的溶解度。此时乳清蛋白表面积增大，乳清蛋白在油/水界面处可能更快地吸附。综合考虑纳米乳液的稳定性和超声设备使用过程中的能量消耗，选取超声时间为23 min。

2.1.5 超声功率对纳米乳液的形成和稳定的影响

本环节固定乳清蛋白与OSA变性淀粉质量比为7∶3，乳化剂质量分数为5%，油相质量分数度为1%，超声时间为23 min，考察超声功率对纳米乳液稳定性的影响。超声功率从120 W增加到240 W，纳米乳液的粒径变化不显著(P>0.05)；超声功率从240 W增加到360 W，纳米乳液的粒径显著(P<0.05)减小了5 nm (图5)。这可能是因为当超声功率达到一定值时，随着超声功率的增加，超声产生的空化气泡数量增加，气泡周围能量增强，液滴更容易分散，从而使纳米乳液的粒径减小，稳定性更好[20-21]。超声功率在360 W的基础上增大时，纳米乳液的粒径存在减小趋势，但变化不显著。因此选取超声功率360 W。

图5 超声功率对纳米乳液的形成和稳定的影响Fig.5 Effect of ultrasonic power on the formation and stabilization of nanoemulsions

2.2 环境因素对乳清蛋白-OSA变性淀粉纳米乳液稳定性的影响

2.2.1 pH

当乳清蛋白纳米乳液的pH降低到4时，其粒径显著增大至2 100 nm，并且在短时间内(143 h)继续迅速增大(图6)，出现分层现象，说明此时的纳米乳液极不稳定，这可能是因为此时pH在乳清蛋白等电点附近，液滴容易发生聚集而使粒径增大[22]。通过乳清蛋白和OSA变性淀粉组合制备的纳米乳液在pH=4处的粒径显著减小(图6)至280 nm，说明添加OSA变性淀粉能有效减小乳清蛋白纳米乳液在其等电点处的粒径变化。

A-乳清蛋白纳米乳液;B-乳清蛋白-OSA变性淀粉纳米乳液图6 pH对乳清蛋白纳米乳液和乳清蛋白-OSA变性淀粉纳米乳液稳定性的影响Fig.6 Effect of pH on the stability of nanoemulsions prepared with whey protein and with whey protein-OSA modified starch

这可能是因为OSA变性淀粉多分支结构形成的空间位阻可进一步稳定液滴，在蛋白质等电点附近增加纳米乳液的稳定性[11]。这提示了在偏酸性(蛋白质等电点附近)条件下，添加一定量OSA变性淀粉可以在一定程度上增强乳清蛋白纳米乳液的稳定性。

2.2.2 离子强度

不同Na+浓度(0.2～1.0 mol/L)对乳清蛋白纳米乳液没有显著(P>0.05)影响，纳米乳液的粒径基本保持在170 nm左右(图7)。在乳化剂中添加OSA变性淀粉后，Na+浓度从0增大到0.6 mol/L的过程中，纳米乳液的粒径无显著变化(图7)，说明低Na+浓度对乳清蛋白-OSA变性淀粉纳米乳液粒径无显著(P>0.05)影响。当Na+浓度从0.6 mol/L增大到0.8 mol/L时，乳清蛋白-OSA变性淀粉纳米乳液的粒径由190 nm显著(P<0.05)增大到197 nm(图7)。这可能是因为在较低Na+浓度下，液滴间的静电排斥作用可以克服疏水相互作用和范德华力[23]；但当Na+浓度大于临界浓度(0.6 mol/L)时，Na+能够中和乳清蛋白和OSA变性淀粉分子的负电荷，削弱液滴间的静电排斥作用，使液滴间发生聚集，从而增大纳米乳液的粒径。

A-乳清蛋白纳米乳液;B-乳清蛋白-OSA变性淀粉纳米乳液图7 Na+浓度对乳清蛋白纳米乳液和乳清蛋白-OSA变性淀粉纳米乳液稳定性的影响Fig.7 Effect of sodium ion concentration on the stability of nanoemulsions prepared with whey protein and with whey protein-OSA modified starch

随着Ca2+浓度的增加，纳米乳液的粒径呈现明显的上升趋势。Ca2+浓度从0增大到0.004 mol/L过程中，乳清蛋白纳米乳液粒径变化不显著；从0.004 mol/L增大到0.032 mol/L过程中，乳清蛋白纳米乳液的粒径显著增加了38 nm(图8)。在乳清蛋白-OSA变性淀粉纳米乳液中，Ca2+浓度从0增加到0.004 mol/L，纳米乳液粒径显著(P<0.05)增加17 nm(图8)，说明Ca2+浓度很低时，乳清蛋白-OSA变性淀粉纳米乳液中液滴易发生聚集，从而导致粒径增加。Ca2+的静电屏蔽作用和离子结合效应，导致纳米乳液粒径增大，稳定性降低[24-25]。Ca2+浓度从0.004 mol/L增大到0.024 mol/L过程中，乳清蛋白-OSA变性淀粉纳米乳液的粒径显著(P<0.05)增加了90 nm(图8)。综上可知，Ca2+对纳米乳液粒径的影响比Na+大，这是因为多化合价离子的静电屏蔽作用比单化合价离子强，在低浓度下可屏蔽更多的电荷数[26]。

A-乳清蛋白纳米乳液;B-乳清蛋白-OSA变性淀粉纳米乳液图8 Ca2+浓度对乳清蛋白纳米乳液和乳清蛋白-OSA变性淀粉纳米乳液稳定性的影响Fig.8 Effect of calcium ion concentration on the stability of nanoemulsions prepared with whey protein and with whey protein-OSA modified starch

2.2.3 热处理

不同温度(40～90 ℃)处理下乳清蛋白纳米乳液的粒径无显著(P>0.05)变化，乳清蛋白纳米乳液粒径基本保持在172 nm左右(图9)。这表明仅通过乳清蛋白稳定的纳米乳液具有良好的热稳定性，这可能是因为纳米乳液中的液滴之间的强静电排斥，避免了高温下液滴表面上蛋白质分子间的相互作用[27]。经热处理后的2种纳米乳液均在室温下保存7 d而无液滴絮凝的现象。乳清蛋白-OSA变性淀粉纳米乳液粒径基本维持在184 nm左右，除了温度升高到90 ℃ 时，乳液粒径有增大的趋势(图9)。这提示了在乳化剂中添加一定量OSA变性淀粉后，一定温度下(40～80 ℃)纳米乳液的粒径没有显著变化。

A-乳清蛋白纳米乳液;B-乳清蛋白-OSA变性淀粉纳米乳液图9 温度对乳清蛋白纳米乳液和乳清蛋白-OSA变性淀粉纳米乳液稳定性的影响Fig.9 Effect of temperature on the stability of nanoemulsions prepared with whey protein and with whey protein-OSA modified starch

3 结论

以乳清蛋白-OSA变性淀粉为复合乳化剂，通过超声均质法成功制备的乳清蛋白-OSA变性淀粉纳米乳液的粒径为(182.5±1.3) nm，PDI为(0.19±0.01)。通过稳定性试验发现，在pH=4时，乳清蛋白纳米乳液粒径极大，为2 100 nm。而乳清蛋白和OSA变性淀粉组合制备的纳米乳液的粒径减小到280 nm。当pH>6时，2种纳米乳液粒径基本保持不变，稳定性较好。在Na+浓度小于0.6 mol/L时，乳清蛋白-OSA变性淀粉制备的纳米乳液的粒径没有显著变化；在考察的Ca2+浓度下，乳清蛋白-OSA变性淀粉制备的纳米乳液粒径增大幅度大于乳清蛋白制备的纳米乳液。乳清蛋白-OSA变性淀粉纳米乳液粒径在40～80 ℃下无显著变化，纳米乳液的粒径在该温度下能保持较好的稳定性。