枯草芽孢杆菌SX3411产羊毛硫细菌素subtilomycin的 初步鉴定与理化特性分析

李晓然，叶德晓，付鸣佳*，钟雪晴，肖世平，杨志海

1(江西师范大学 生命科学学院，江西 南昌，330022) 2(江西天佳生物工程股份有限公司，江西 南昌，330200)

枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)是自然界中存在较为丰富的一个类群，并适应了自然界的各种环境变化[1]。枯草芽孢杆菌已经形成了许多的适应环境的机制，如外源DNA的摄取、生物膜形成和芽孢形成[2-4]。因此，枯草芽孢杆菌可从许多场所和严酷的环境中分离得到[5-6]。有证据表明，枯草芽孢杆菌可活跃地生长在土壤、植物根系和各种有机体的胃肠道中。特别是对几种无脊椎动物和脊椎动物(包括人类)肠道中枯草芽孢杆菌研究表明，它可以作为动物自然生命周期的一部分在胃肠道定居[5，7-11]。

枯草芽孢杆菌中可以产生多种抗菌物质，具有较好的开发利用价值[12-14]。在枯草芽孢杆菌中产生的翻译后修饰的抗菌物质包括脂肽(lipopeptide)、糖肽(glycopeptide)和羊毛硫细菌素(lantibiotic)等[15-17]。其中枯草芽孢杆菌中可以合成多种羊毛硫细菌素(lantibiotics)，羊毛硫细菌素也可称为含羊毛硫氨酸的抗生素(lanthionine-containing antibiotics)[18]。羊毛硫细菌素是在核糖体上合成，并在翻译后修饰的抗菌肽[19-21]。从枯草芽孢杆菌中已经发现多种羊毛硫细菌素，但这些羊毛硫细菌素均来源于不同的菌株。其中枯草菌素(subtilin)就来源于菌株BacillussubtilisATCC 6633，可形成4个甲基羊毛硫氨酸[22]。羊毛硫细菌素Ericin S和Ericin A产生菌均为B.subtilisA1/3菌株，但Ericin S的结构与枯草素的结构非常相似[23]。Entianin来自B.subtilissubsp. spizizenii DSM 15029T[24]。目前的研究中，已经采用更多的先进手段来进行羊毛硫细菌素的发掘[25]。

羊毛硫细菌素subtilomycin最初报道来源于B.subtilisstrain MMA7，该菌株分离自海绵Haliclonasimulans中[26]，后在B.subtilisBSn5菌株中也发现有subtilomycin[27]。对B.subtilisstrain MMA7中subtilomycin基因簇进行分析表明，其基因簇主要的subtilomycin合成基因包括subA(subtilomycin结构基因)、subB(羊毛硫氨酸脱水酶(lanthionine dehydratase)基因)、subC(羊毛硫氨酸合成酶(lanthionine synthetase)基因)和subP(丝氨酸蛋白酶(serine protease)基因)；subT为ABC转运蛋白[26]。而通过对B.subtilisBSn5菌株中subtilomycin基因簇测序分析表明，其基因簇与B.subtilisstrain MMA7中subtilomycin基因簇基本相同，但确定了一个穿膜蛋白(transmembrane protein)ApnI对subtilomycin功能是必须的[27]。我们在前期的研究中也分离到1株产subtilomycin的枯草芽孢杆菌菌株，并进行了相关的理化特性和分离纯化研究。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

从江西省南昌市分离获得枯草芽孢杆菌SX3411菌株(B.subtilisSX3411)，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌种保藏号CGMCC NO.14396。其他指示菌株包括革兰氏阳性菌：猪链球菌(Streptococcussuis)、枯草芽孢杆菌(非本筛选菌株)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)；革兰氏阴性菌：嗜水性单胞杆菌(Aeromonashydrophila)、沙门氏杆菌(Salmonellaentericasubsp.)和大肠杆菌(Escherichiacoli.)，均保存于本实验室。

革兰氏染色液试剂盒、芽孢染色液试剂盒，北京索莱宝科技有限公司；2×Taq PCR Master Mix，天根生化(北京)科技有限公司；E.Z.N.A. TM Bacterial DNA Kit，OMEGA BIO-TEK；SDS-PAGE凝胶配制试剂盒，博士德生物工程有限公司；胰蛋白酶、胃蛋白酶，上海蓝季生物有限公司；蛋白酶K,MERCK公司；其他生化试剂为生工生物工程股份有限公司产品，化学试剂为天津市永大化学试剂开发中心产品，均为分析纯。

1.2 培养基

LB培养基为基础培养基(g/L)：蛋白胨10.0，酵母提取物5.0， NaCl 5.0，pH 7.2, 加水定容1 L, 121 ℃灭菌20 min，固体培养基每1 L加15.0 g琼脂粉。

模拟胃消化液(stimulated gastric fluid, SGF)：取稀HCl(HCl 234 mL，加水稀释至1 000 mL制得)16.4 ml， 加水约800 mL与胃蛋白酶10 g，摇匀后，加水稀释成1 000 mL[28]。

模拟肠消化液(stimulated intestinal fluid, SIF)：取KH2PO46.8 g，加水500 mL使溶解，用0.1 mol/L NaOH溶液调节pH值至6.8；另取胰酶10 g，加水适量使溶解，将两液混合后，加水稀释至1 000 mL[28]。

1.3 仪器与设备

D-37520 Osterode型台式高速离心机，美国Thermo公司；PTC-200型PCR仪，美国MJ-Research公司；ZHWY-103B型、ZHWY-2102型恒温培养振荡器，上海智城分析仪器制造有限公司；HT-1300-U超净工作台，苏净集团安泰公司；FE20型pH计，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；ALO-210.2型电子天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司。

1.4 方法

1.4.1 SX3411菌株的分离

从猪场污泥中得到的菌种样品，经过高温处理后，接种到LB固体培养基中，置于37 ℃恒温培养箱中培养过夜。观察菌落形态，挑取芽孢杆菌形态的单克隆菌落，进行后续鉴定。

1.4.2 滤纸片法测定抑菌活性

每个培养皿倾入20～30 mL LB固体培养基，凝固后，超净台上吹干冷凝水；涂布100 μL指示菌悬液， 37 ℃培养10 min。2层滤纸片(直径8 mm)轻轻黏在制备好的抑菌平板上，轻轻按压一下。取25 μL SX3411菌株的发酵液缓慢滴到滤纸片上，按照顺时针方向进行实验。加完样品后，放在4 ℃冰箱4 h以上使发酵液在琼脂糖平板上充分扩散，然后放置在37 ℃恒温培养箱培养12 h左右，定时查看抑菌圈出现的情况，做好记录和测量抑菌圈直径。新鲜LB液体培养基作为阴性对照。

1.4.3 菌体形态鉴定

将活化好的枯草芽孢杆菌SX3411划线接种至固体平板培养基中，37 ℃恒温培养24 h，按照试剂盒说明书进行革兰氏染色、芽孢染色、荚膜染色。使用光学显微镜观察菌体细胞个体形态。

1.4.4 生理生化鉴定

SX3411菌株的生理生化鉴定参照《伯杰氏菌种鉴定手册》进行试验[29]。

1.4.5 16S rDNA序列鉴定

E.Z.N.A. TM Bacterial DNA Kit试剂盒抽提SX3411菌株基因组DNA(方法见试剂盒说明书)。用南京金斯瑞生物科技有限公司合成的上下游通用引物27F和1 492R(27F: AGAGTTTGATCCTGGCTCAG; 1492R: GGTTACCTTGTTACGACTT)对枯草芽孢杆菌基因组DNA进行PCR扩增。

1.4.6 枯草芽孢杆菌菌株SX3411中subtilomycin基因簇的分子生物学鉴定

根据NCBI上给出的枯草芽孢杆菌B.subtilisstrain MMA7中subtilomycin基因簇(GenBank序列号：JX912247.1)中的结构基因SubA、脱水酶基因SubB与环化酶基因SubC和丝氨酸蛋白酶基因SubP的DNA序列[26]，使用Primer 5.0和Oligo 6.0软件分别设计SubA、SubB、SubC、SubP基因的引物(表1)；引物送至南京金斯瑞生物科技有限责任公司合成。根据不同的鉴定DNA序列长短，进行相应的PCR扩增，PCR扩增后得到的DNA送南京金斯瑞生物科技公司测序。

1.4.7 菌株SX3411发酵产物的抗菌谱

分别取菌株SX3411在37 ℃培养了24 h的发酵液，10 000 r/min离心15 min，弃菌体取上清液，即得到抗菌物质粗提液。分别用指示菌悬液涂布平板，按滤纸片法测定抑菌活性，测定SX3411的发酵液对不同指示菌的抑菌活性。

表1 检测subtilomycin基因簇的PCR引物Table 1 Primers used for PCR detection of subtilomycin cluster

1.4.8 菌株SX3411生长曲线与抑菌活性的关系

接种新鲜的SX3411菌株，37 ℃摇床200 r/min振荡培养，每隔2 h取1次发酵液在紫外分光光度计上测OD600值，记录结果。同时将所取的发酵液10 000 r/min 离心15 min，取上清液用于抑菌活性检测。以金黄色葡萄球菌为指示菌，滤纸片法检测各时间取样的抑菌效果。

1.4.9 菌株SX3411发酵所产抑菌物质热稳定性

取37 ℃发酵培养24 h的SX3411菌株发酵液，分别在40、60、80和100 ℃下水浴处理30 min和1 h，以未处理的发酵液为阳性对照，灭菌新鲜的LB液体培养基为阴性对照，以金黄色葡萄球菌为指示菌株，检测不同温度对SX3411菌株发酵液抑菌活性的影响。

1.4.10 菌株SX3411发酵所产抑菌物质酸碱稳定性

取37 ℃发酵培养24 h的SX3411菌株发酵液，分别用0.1 mol/L HCl溶液和0.1 mol/L NaOH溶液调节pH值至2、4、5、7、8、9、10和11，以不做处理的菌株发酵液作阳性对照，新鲜LB液体培养基为阴性对照，室温下处理1 h。以金黄色葡萄球菌为指示菌株，检测不同pH处理下发酵液的抑菌活性。

1.4.11 超滤法粗提subtilomycin及其抑菌活性

将枯草芽孢杆菌SX3411在37 ℃发酵培养24 h，其发酵液10 000 r/min离心15 min，弃菌体取上清液。取500 μL菌株SX3411发酵液于3 kDa超滤管中(美国Millipore公司产品)，10 000 r/min离心10 min，收集管中的滤过液进行抑菌活性检测。超滤管内截留液继续加入50 mmo1/L PBS(pH 7.4)缓冲液，10 000 r/min 离心10 min，重复该步骤3次。随后将超滤得到截留液进行抑菌活性检测。同时采用15% SDS-PAGE电泳(凝胶配制见试剂盒说明书，电泳方法略)检测超滤得到的截留液。

1.4.12 硫酸铵沉淀初步纯化菌株SX3411发酵液中subtilomycin

将枯草芽孢杆菌SX3411在37 ℃发酵培养24 h的发酵液10 000 r/min离心20 min取上清液。其中加(NH4)2SO4分别至20%、30%、40%、50%、60%和70%饱和度，置4 ℃下过夜。高速冷冻离心机在10 000 r/min， 4 ℃下离心20 min。每40 mL发酵液所得沉淀用2 mL浓度为50 mmo1/L PBS(pH 7.4)缓冲液悬浮。以金黄色葡萄球菌为指示菌，检测不同饱和度(NH4)2SO4沉淀所得初步纯化subtilomycin的抑菌活性。

1.4.13 初步纯化subtilomycin的温度稳定性

用30%硫酸铵饱和度初步纯化的subtilomycin，分别在40、60、80和100 ℃下各处理30 min和1 h，以未处理的初步纯化subtilomycin作阳性对照，灭菌的PBS为阴性对照，以金黄色葡萄球菌为指示菌株，检测不同温度处理对subtilomycin抑菌活性的影响。

1.4.14 初步纯化subtilomycin对蛋白酶K、模拟胃液和模拟肠液的稳定性

初步纯化的subtilomycin分别用0.5 g/L蛋白酶K、模拟胃液、模拟肠液消化处理，分别处理15和30 min。 用模拟胃液和模拟肠液为阴性对照，以金黄色葡萄球菌为指示菌株，检测不同蛋白酶处理下初步纯化subtilomycin的抑菌活性。

2 结果与分析

2.1 抑菌菌株的筛选

从取得的样品中获得芽孢杆菌菌落形态特征的菌株，用滤纸片扩散法检测获得的发酵液，从中筛选得到具有明显抑菌圈的菌株。经筛选比较，挑选1株抑菌效果较好的菌株(图1)，命名为SX3411菌株。

2.2 菌株SX3411的形态

用活化好的SX3411菌种使用接种环划线接种于LB固体培养基，培养1～2 d后观察菌落形态呈现芽孢杆菌特征形态。菌体进行革兰氏染色、芽孢染色和荚膜染色，1 000×油镜下观察，菌株SX3411菌体革兰氏染色为阳性反应，菌体呈杆状(图2-A)。芽孢染色(图2-B)和荚膜染色(图2-C)均呈阳性。

图1 筛选菌株SX3411的抑菌效果Fig.1 Bacteriostatic efficacy of screened strain SX3411注：指示菌为金黄色葡萄球菌。

A-革兰氏染色；B-芽孢染色；C-荚膜染色图2 菌株SX3411菌体形态Fig.2 Morphology of strain SX3411

2.3 菌株鉴定

2.3.1 生理生化鉴定

菌株SX3411在5 ℃下基本不生长，20 ℃下生长较缓慢，30～50 ℃下菌株生长良好，50 ℃下生长8 h即可看到菌落产生，表明为耐高温生长菌株。不同酸碱度检测表明，该菌株在pH 6～9时菌株生长较好；最适生长pH值在6～9。在NaCl质量分数为2%～5%的培养基中生长较好；丙二酸利用实验结果显示阴性；柠檬酸盐利用实验呈阳性；接触酶实验表现阳性；蔗糖发酵实验可产酸，呈阳性；葡萄糖氧化发酵实验表明菌株SX3411发酵产酸但不产气；淀粉水解实验呈阳性；MR反应呈阴性；V-P反应阳性；SX3411菌株穿刺接种，可导致明胶液化；菌株SX3411不能利用乙醇，乙醇氧化呈阴性；菌株可以利用乙酸产生碳酸，在平板中生成CaCO3，乙酸氧化呈阳性。根据《伯杰氏菌株鉴定手册》可以初步确定菌株SX3411为枯草芽孢杆菌[29]。

2.3.2 菌株SX3411的16S rDNA序列鉴定

提取菌株SX3411基因组DNA，以细菌特异的16S rDNA引物进行PCR扩增，可得到大小为1 500 bp左右DNA(图3-A)，测序后得到GenBank序列号为KY848340.1。通过NCBI数据库中已知菌株的16S rDNA序列进行比对分析，构建系统发育进化树(图3-B)，菌株SX3411与枯草芽孢杆菌(B.subtilis)具有较高的同源性，达到99%，可以确定菌株SX3411为枯草芽孢杆菌。

A-PCR扩增；B-系统发育进化树图3 菌株SX3411 16S rDNA的PCR扩增和系统发育进化树Fig.3 PCR analysis and phylogenetic tree of strain SX3411 16S rDNA

2.4 菌株SX3411中subtilomycin基因簇的分子生物学鉴定

根据subtilomycin基因簇(GenBank序列号JX912247.1)的相关基因序列设计引物，分别以枯草芽孢杆菌SX3411中的基因组DNA为模版进行PCR扩增。结果获得了subA(图4-A)、subB(图4-B)、subC(图4-C)、subP(图4-C)、subP-subB(图4-D)、subP-subB-subC(图4-E)和subB-subC(图4-E)的PCR扩增产物。扩增产物分别送DNA测序公司测序，测序结果在NCBI上进行比对，其序列与subtilomycin基因簇序列完全相同[26]。由此表明，在枯草芽孢杆菌SX3411中存在可以合成subtilomycin的基因簇。

A-subA基因的PCR扩增；B-subB基因的PCR扩增；C-subC和subP基因的PCR扩增；D-subP-subB基因的PCR扩增；E-subP-subB-subC和subB-subC基因的PCR扩增图4 Subtilomycin基因簇相关基因的PCR扩增Fig.4 PCR amplification of subtilomycin cluster related genes

2.5 菌株SX3411发酵产物的抗菌谱

SX3411菌株的发酵液对革兰氏阳性菌具有强抑菌活性，其中对金黄色葡萄球菌和猪链球菌的抑菌效果最明显，对枯草芽孢杆菌(非筛选菌株)也具有抑菌作用，但对于SX3411菌株本身不具有抑菌效果，这可能跟SX3411菌株本身会产生免疫蛋白有关。在检测的革兰氏阴性细菌中，只对嗜水气单胞杆菌有抑菌活性，对大肠杆菌和沙门氏菌无抑菌活性(表2)。

表2 枯草芽孢杆菌SX3411发酵液对供试菌种的抑制作用Table 2 Antimicrobial spectrum of bacteriostatic substances produced by B. subtilis SX3411

注：“+++”，抑菌圈完全透明；“++”，抑菌圈清晰；“+”，抑菌圈可见；“-”，无抑菌圈。

2.6 菌株SX3411发酵产物的生长曲线与抑菌物质的分泌关系

将培养好枯草芽孢杆菌SX3411的种子液(OD600约为1)，按2%的接种量接种至发酵培养基，每隔2 h测定菌液OD600值，以未接种的发酵培养基为空白对照，检测SX3411菌株的生长情况(图5-A)。结果表明，0～2 h为生长停滞期，菌体数量较少，2～20 h为对数期，菌体生长迅速，呈指数增长，20～34 h为稳定期，菌体数量比较稳定，34 h后为衰退期，菌体因为营养条件和代谢物的影响，活性开始衰减(图5-A)。根据菌株的生长曲线可以掌握枯草芽孢杆菌SX3411的生长代谢规律，从而调控其生长条件，为后续的实验奠定基础。

枯草芽孢杆菌SX3411的发酵液具有抑菌作用，发酵产物分为初级代谢产物和次级代谢产物，发酵时间对枯草芽孢杆菌SX3411抑菌物质的分泌具有关联(图5-B)。抑菌物质随着菌株的生长而分泌，并随着发酵时间而慢慢积累，到8 h达到一定的抑菌效果，在20～38 h抑菌活性比较稳定，40 h后其抗菌活性出现了下降(图5-B)。可以推测枯草芽孢杆菌SX3411所产的抑菌物质，尤其是subtilomycin尽管是翻译后的修饰，但也是枯草芽孢杆菌SX3411的初级代谢产物，抑菌物质的产生与其生长相关。

A-生长曲线；B-抑菌活性图5 枯草芽孢杆菌SX3411生长曲线及其抑菌物质抑菌活性随时间的变化Fig.5 Growth curve of B. subtilis SX3411 and changes of antimicrobial activity of its antimicrobial substances with time

2.7 菌株SX3411抑菌物质的热稳定性

菌株SX3411发酵液的抑菌活性随着温度的升高而降低，且在100 ℃时，发酵液失去抑菌活性；发酵液在40～60 ℃处理下对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径在12～15 mm，与未处理的原始发酵液相差不大，此期间的发酵液抑菌活性相对稳定；发酵液在80 ℃处理下，仍然具有抑菌活性(图6)。由此可知，SX3411菌株发酵液中抑菌物质具有较好的热稳定性。这与确认的发酵液中主要的抑菌物质为羊毛硫细菌素subtilomycin有关，因subtilomycin是热稳定的环肽类物质。

图6 枯草芽孢杆菌SX3411发酵产物中抑菌物质的热稳定性Fig.6 Thermal stability of bacteriostatic substances in fermentation products of B. subtilis SX3411

2.8 菌株SX3411发酵产物的酸碱稳定性

菌株SX3411发酵液抑菌活性成分在pH 5～9比较稳定，发酵液在pH 5～9处理后对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径均在12.0～13.0 mm，与未处理的发酵液相差不大；且此菌株发酵液在pH值为2和11处理下，对金黄色葡萄球菌仍有抑制作用，而pH值为12时，活性降低或失去抑菌活性(图7)。由此可见，SX3411菌株发酵液的抑菌活性在中性及弱碱性条件下较稳定，对酸的耐受性高于对强碱的耐受性。

图7 枯草芽孢杆菌SX3411发酵产物中抑菌物质的酸碱稳定性Fig.7 pH stability of bacteriostatic substances in fermentation products of B. subtilis SX3411

2.9 超滤法粗提subtilomycin及其抑菌活性

与发酵液相比较(图8-Aa)，使用3 kDa超滤管进行超滤后，截留液保存了较好的抑菌活性，可以看到明显的抑菌圈(图8-Ab)，而滤过液基本没有抑菌活性，无抑菌圈产生(图8-Ac)。由此表明，枯草芽孢杆菌SX3411发酵液的抑菌活性主要体现在多肽类物质上，小分子物质基本没有抑菌活性。截留液经过SDS-PAGE电泳以后，可以看到在4 kDa左右有条带(图8-B2)，初步认为是subtilomycin。发酵液原液(图8-B1)和滤过液(图8-B3)经过SDS-PAGE电泳未见明显条带。综合分析，在枯草芽孢杆菌SX3411的发酵液中，抗菌物质主要是subtilomycin。因此，在后续研究中可以以抑菌能力的大小来判断枯草芽孢杆菌SX3411的发酵液中产subtilomycin的量。

A-抑菌活性；B-SDS-PAGE分析图8 枯草芽孢杆菌SX3411发酵液超滤后的抑菌活性和SDS-PAGE分析Fig.8 Antimicrobial activity and SDS-PAGE analysis of B. subtilis SX3411 fermentation liquor after ultrafiltration注：Aa为发酵液原液的抑菌活性，Ab为截留液的抑菌活性，Ac为滤过液的抑菌活性。

2.10 硫酸铵沉淀初步纯化菌株SX3411发酵液中的subtilomycin

枯草芽孢杆菌SX3411经过(NH4)2SO4沉淀后，其中20%、30%和40%(NH4)2SO4沉淀物有较好的抑菌效果，以30%的沉淀物抑菌效果最好，而50%、60%和70%的硫酸铵沉淀物抑菌效果不好(图9-A和9-B)。这样的结果与所报道的20%(NH4)2SO4沉淀得到subtilomycin接近一致[16]。

对这6个浓度的(NH4)2SO4沉淀物进行SDS-PAGE分析(图10)，结果表明，在20%、30%和40%的硫酸铵沉淀中，可以见到4 kDa左右的电泳带，其中以30%的量最多且杂质较少(图10-A)。而在50%、60%和70%的(NH4)2SO4沉淀中可以见到较多的杂电泳带。将20%、30%和40%(NH4)2SO4沉淀进一步超滤以后再进行电泳，结果30%和20%的沉淀物电泳以后仍可见到较好的4 kDa电泳带，且含杂质也较少。由于subtilomycin是由硫醚键形成带有4个环的环肽，且含碱性氨基酸比例较高，为阳离子肽[16]，因此电泳条带并不像普通蛋白质电泳带那样规整。

A-抑菌圈直径；B-抑菌效果图9 枯草芽孢杆菌SX3411发酵液(NH4)2SO4沉淀物的抑菌效果Fig.9 Antibacterial effect of ammonium sulfate precipitates from B. subtilis SX3411 fermentation broth注：指示菌为金黄色葡萄球菌。

A-硫酸铵沉淀；B-超滤后SDS-PAGE图图10 枯草芽孢杆菌SX3411发酵液硫酸铵沉淀及其超滤后的SDS-PAGE分析Fig.10 SDS-PAGE analysis of ammonium sulfate precipitation and retaining solution of ultrafiltration after ammonium sulfate precipitation for B. subtilis SX3411 fermentation broth

2.11 初步纯化subtilomycin的温度稳定性

将30%(NH4)2SO4沉淀和超滤初步纯化的subtilomycin 分别在不同温度下处理不同时间，以未处理的30%(NH4)2SO4沉淀和超滤初步纯化的subtilomycin作阳性对照，灭菌的PBS溶液作阴性对照，检测抑菌效果的变化(图11)。结果表明，与未处理初步纯化的subtilomycin相比，初步纯化的subtilomycin在40～ 80 ℃处理后抑菌活性改变不大；100 ℃处理30 min， 活性下降较少，处理1 h后，抑菌活性才有一定下降，说明枯草芽孢杆菌SX3411分泌的subtilomycin具有较好的温度耐受性(图11)。

图11 枯草芽孢杆菌SX3411粗提subtilomycin的温度稳定性Fig.11 Temperature stability of subtilomycin extracted from B. subtilis SX3411

2.12 初步纯化的subtilomycin对蛋白酶K、模拟胃液和肠液稳定性

以未处理的30%(NH4)2SO4沉淀和超滤初步纯化的subtilomycin为阳性对照，蛋白酶K、模拟胃液和模拟肠液为阴性对照，将30%硫酸铵沉淀和超滤初步纯化的subtilomycin样品用蛋白酶K、模拟胃液和模拟肠液分别处理15及30 min，对其检测抑菌活性的变化。实验结果表明，蛋白酶K、模拟肠液处理后的初步纯化的subtilomycin失去抑菌活性；模拟胃液处理15和30 min后的初步纯化的subtilomycin仍然具有抑菌活性，与未处理的初步纯化的subtilomycin相比变化不大(图12)。

图12 枯草芽孢杆菌SX3411的 subtilomycin对蛋白酶K、模拟胃液和模拟肠液的稳定性Fig.12 Stability of subtilomycin from B. subtilis SX3411 to protease K, simulated gastric fluid and simulated intestinal fluid注：0-未处理的subtilomycin，1-模拟胃液，2-模拟胃液处理subtilomycin 15 min，3-模拟胃液处理subtilomycin 30 min，4-模拟肠液，5-模拟肠液处理subtilomycin 15 min，6-模拟肠液处理subtilomycin 30 min，7-蛋白酶K，8-蛋白酶K处理subtilomycin 15 min，9-蛋白酶K处理subtilomycin 30 min。

3 结论

从江西省南昌市分离获得了1株细菌SX3411，经过形态鉴定、生理生化鉴定和分子生物学鉴定，确定该菌株为枯草芽孢杆菌。根据NCBI中羊毛硫细菌素subtilomycin的基因簇序列(GenBank序列号：JX912247.1)中的结构基因SubA、脱水酶基因SubB与环化酶基因SubC和丝氨酸蛋白酶基因SubP的DNA序列，设计引物对枯草芽孢杆菌SX3411中合成subtilomycin的结构基因和修饰酶基因进行了PCR的扩增和测序分析，结果证明了枯草芽孢杆菌中存在subtilomycin的基因簇，表明该菌株可以合成羊毛硫细菌素subtilomycin。

对枯草芽孢杆菌SX3411发酵液中的抑菌物质进行了生理生化和生物活性方面的研究。枯草芽孢杆菌SX3411发酵液对革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌、猪链球菌和枯草芽孢杆菌具有明显抑菌作用，而对革兰氏阴性菌的抑菌作用相对较弱，检测菌种中对嗜水气单胞杆菌有一定抑菌效果，对其他菌无效果。研究表明，枯草芽孢杆菌SX3411发酵液产抑菌物质与其菌体生长有密切关系，且该类抑菌活性物质具有很好的耐高温和耐酸碱的能力，其中在80 ℃处理仍保持有较好的抑菌活性，在pH 2～11有抑菌活性，在pH 5～9抑菌活性比较稳定。

采用超滤和硫酸铵沉淀的方法对枯草芽孢杆菌SX3411中的subtilomycin进行了初步纯化。在用3 kDa超滤管超滤时，经过SDS-PAGE电泳可以见到数量较多的4 kDa左右的subtilomycin存在。采用硫酸铵分步沉淀的方法，20%、30%和40%饱和度的硫酸铵沉淀可以将subtilomycin沉淀下来，其中以30%硫酸铵沉淀效果较好，获得的subtilomycin也比较纯。30%硫酸铵沉淀和超滤初步纯化的subtilomycin有非常好的抵抗高温的作用，对模拟胃液有较好的抵抗作用，但对蛋白酶K和模拟肠液的抵抗能力较弱。这些结果表明，羊毛硫细菌素subtilomycin比较适合工业化生产，且可以用于调节胃部的有害菌群。枯草芽孢杆菌SX3411也可以做为益生菌进行开发利用。