2型糖尿病大鼠各组织及体液中锌、镁、铜、铁、钙五种元素的变化规律

龚 频， 刘 萌， 李晓凡， 文 和

(陕西科技大学 食品与生物工程学院， 陕西 西安 710021)

0 引言

流行病学调查显示，我国大约有1.14亿糖尿病患者，糖尿病发病率已经达到11.6%.2017年国务院办公厅印发《中国防治慢性病中长期规划(2017～2025年)》中指出糖尿病是我国慢性病中长期防治工作的重点领域.由于糖代谢障碍，2型糖尿病病人常常伴有微量元素镁( Mg) 、铁( Fe) 、锌( Zn) 、铜( Cu) 、钙( Ca) 的代谢紊乱，可能是由于这些元素在糖尿病及其并发症的发生发展中起着特定的作用[1-4]，这些必需元素的缺乏或过量可能造成病情的加重[5,6].

本实验以高脂高糖和链脲佐菌素诱导的2型糖尿病大鼠模型为研究对象，对大鼠各组织及体液中的锌、铜、镁、钙、铁五种元素进行含量测定，通过比较正常组及高脂高糖组大鼠各组织及体液中的元素含量，观察其变化规律，阐明糖尿病必需元素变化的规律，从而为2型糖尿病的防治提供理论依据.

1 材料与方法

1.1 实验材料及仪器

1.1.1 实验材料

清洁级SD大鼠30只，雄性(♂) ，体重约190～220 g，于西安交通大学医学部实验动物中心购买.

生理盐水，购于西安双鹤制药有限公司；磷酸氢二钠、ZnSO4·7H2O、磷酸二氢钠,购于成都金山化工试剂厂；浓硝酸、CH3COONa,购于天津市河东区红岩试剂厂；硫酸铁铵、MgSO4·7H2O,购于天津市天力化学试剂有限公司；CuSO4·5H2O，购于天津市巴斯夫化工有限公司；CaSO4·2H2O，购于天津市科密欧化学试剂有限公司.

1.1.2 实验仪器

TDL-40B型电子天平，上海精密科学仪器有限公司；PHS-3C型精密PH计，上海雷磁仪器公司；Z-2000型塞曼偏振光原子吸收光谱仪，日本HITACHI公司；SX-4-10型马弗炉，北京科伟永兴仪器公司.

1.2 实验动物模型建立

30只大鼠适应性喂养两周，自由进水进食，两周后将大鼠完全随机分为3组，每组10只(K、G、S).K组为空白组，普通饲料喂养；G组为高脂高糖组，高脂高糖饲料喂养；S组为损伤组，高脂高糖饲料喂养.高脂高糖饲料成分配比如表1所示.

表1 高脂高糖饲料成分配比(%)

六周后，S组大鼠一次性腹腔内注射STZ 30 mg/kg(溶于0.1 mmol/L柠檬酸缓冲液pH 4.4)，K、G组大鼠注射柠檬酸缓冲液pH 4.4.两天后，每日清晨对大鼠称重，观察大鼠生长情况，并进行血糖样本采集.

一般在禁食12小时后，尾静脉取血，采用罗氏血糖仪测其空腹血糖值(FBG )，验证模型搭建是否成功.

1.3 检测方法

1.3.1 组织中的元素含量检测

采用火焰法原子吸收光谱仪检测大鼠组织中各元素含量.

(1)组织中Zn2+含量检测

①锌标准曲线的绘制

准确称取 ZnSO4·7H2O，用双蒸水溶解成含 Zn2+为1 mg/L 的储备液，使用前逐级稀释为0.8、0.6、0.4、0.2 mg/L 的标准液，于-4 ℃冷冻保存.测量时，按照Zn2+浓度从小到大的梯度依次进样，测定不同浓度下 Zn2+溶液的吸光值，绘制锌溶液标准曲线.

②待测样品制备

准确称取一组，3份新鲜组织(包括空白组、高脂高糖组、损伤组)，置于坩埚内，按顺序置于马弗炉中，500 ℃灰化6 h后，自然冷却，用10 mL混酸分三次溶解样品残渣，过滤，最后将样品组织的混酸溶液转移集中，于-4 ℃冷冻保存.

③样品锌元素的测定按照硫酸锌标准液中Zn2+浓度从小到大的顺序依次进样，取得标准曲线.当R2>0.99时，开始进行样品测量.记录数据，实验重复3次，取平均值，绘制大鼠各组织Zn2+含量图.

(2)组织中其余元素含量检测

均与锌元素相同.

1.3.2 血清中的元素含量检测

采用火焰法原子吸收光谱仪进行检测.采用65% HNO3和30% H2O2作为消解试剂，前处理方法为0.25 mL血清，加入0.8 mL 65% HNO3和0.2 mL 30% H2O2，水浴锅中90 ℃加热消解3 h后，用双蒸水稀释至10 mL，于-4 ℃冰箱冷冻保存待测.测量时依旧先绘制标准曲线，当R2>0.99时，开始进行样品测量.记录数据，实验重复3次，取平均值.

1.3.3 尿液中的元素含量检测

建立尿液中元素直接稀释的火焰法原子吸收光谱进行分析.将待测量尿样进行多次过滤，每个尿样取量2 mL于10 mL的离心管稀释至最高刻度，于-4 ℃冰箱冷冻保存待测.

测量时依旧先绘制标准曲线，当R2>0.99时，开始进行样品测量.记录数据，实验重复3次，取平均值[7].

2 结果与讨论

2.1 Zn元素各组织及体液中的含量变化

如图1 所示，高脂高糖组大鼠及损伤组大鼠肝、肾、心、胰组织及血液中Zn2+的含量较空白组明显降低，差异具有统计学意义(p<0.05,p<0.01).高脂高糖组与损伤组大鼠尿液中Zn2+的含量较正常组显著升高(p<0.01).

(a)Zn元素在各组织中的含量

(b)Zn元素在各体液中的含量图1 Zn元素在不同组别各组织及体液中的含量

Zn2+与糖尿病的联系十分紧密，其直接参与人体内胰岛素的生成、分泌、储备、降解以及机体对胰岛素的敏感性.Zn2+分布在β细胞颗粒中，能促进胰岛素的结晶化，提高胰岛素的稳定性，并可调节胰岛素的降糖作用，Zn2+同时也是糖代谢关键酶、3-磷酸甘油酸脱氢酶、乳酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶等的辅酶因子[8,9].葡萄糖诱导Zn2+细胞色素增加，这可能有利于胰岛素的加工和储存及其与Zn2+的共结晶，持续高血糖后Zn2+细胞因子的慢性增加可能导致某些形式的糖尿病中的β细胞功能障碍和死亡.

因而2型糖尿病大鼠肝、肾、心、胰组织及血液中的锌含量减少可能与胰岛细胞受损及数量减少相关，同时，尿液中的Zn2+含量上升，表明体内流失的Zn2+主要通过尿液排泄，高脂高糖模型组Zn2+含量的变化介于正常组和损伤组之间，表明高脂高糖同样也能够引起体内Zn元素的紊乱，最终诱导2型糖尿病的发生.

2.2 Cu元素在各组织及体液中的变化

如图2所示，高脂高糖组大鼠及损伤组大鼠肝、肾、心、胰组织及血、尿液中Cu2+的含量较空白组明显升高，差异具有统计学意义(p<0.05,p<0.01,p<0.001).

铜是参与人体多种酶活性及代谢水平的微量元素，铜被吸收转运后，主要以结合铜蓝蛋白形成存在,可影响体内代谢水平.

本研究中糖尿病大鼠血清中铜元素明显高于正常组，与血浆铜蓝蛋白减少及其结合活性降低有关，从而导致血浆中游离的铜增加.铜引起糖尿病的发病机制尚不明确，可能是由于锌和铜在肠道吸收过程中竞争同一载体蛋白-金属硫蛋白.铜增多时则会影响锌的吸收，使得体内锌大量丢失，而锌的减少会促使糖尿病的发生[10].通常糖尿病患者体内铜含量增高，铜、锌比值增大，机体出现高铜低锌的状态，铜的体内平衡代谢异常会加剧锌元素的平衡的改变.Kiza T G等[11]观察到铜在糖尿病患者血清中含量较高.这也与本研究结果一致.

(a)Cu元素在各组织中的含量

(b)Cu元素在各体液中的含量图2 Cu元素在不同组别各组织及体液中的含量

2.3 Mg元素在各组织及体液中的变化

如图3所示，高脂高糖组大鼠及损伤组大鼠肝、肾、心、胰组织及血液中Mg2+的含量较空白组明显降低，差异具有统计学意义(p<0.05，p<0.01，p<0.001).高脂高糖组与损伤组大鼠尿液中Mg2+的含量较正常组明显升高，差异具有统计学意义(p<0.01，p<0.001).

(a)Mg元素在各组织中的含量

(b)Mg元素在各体液中的含量图3 Mg元素在不同组别各组织及体液中的含量

镁离子是Na+-K+-ATP酶的重要激活剂，与ATP能否发挥正常作用相关，因此镁离子会影响糖代谢过程中许多限速酶和其他重要酶类的生理活性.其含量的变化会直接影响到肝糖原的合成，导致糖异生酶的活性增强，胰岛素对葡萄糖的反应受到抑制，同时低镁的状态还会使胰岛α细胞释放更多的胰高血糖素，因此，糖尿病组大鼠组织与血清中镁元素含量减少.

糖尿病患者肝、肾、心、胰组织及血清镁降低的机理可能为：(1)高血糖的渗透性利尿作用，造成镁持续性地从尿中大量丢失；(2)大量的葡萄糖滤入原尿与镁互相竞争，从而抑制了肾小管对镁的重吸收；(3)糖尿病患者肾小管分泌镁增多以及镁被转移到骨和细胞中；(4)外源性胰岛素的应用可使尿镁排泄增多及肌肉摄取镁增加；(5)维生素D的代谢障碍影响肠道对镁吸收.

2.4 Ca元素在各组织及体液中的变化

如图4所示，高脂高糖组大鼠及损伤组大鼠肝、肾、心、胰组织及血液中Ca2+的含量较空白组明显降低，差异具有统计学意义(p<0.05,p<0.01,p<0.001).高脂高糖组与损伤组大鼠尿液中Ca2+的含量较正常组明显升高，差异具有统计学意义(p<0.01，p<0.001).

(a)Ca元素在各组织中的含量

(b)Ca元素在各体液中的含量图4 Ca元素在不同组别各组织及体液中的含量

胰岛素分泌是由胰岛β细胞内钙离子的迅速升高直接触发的，钙代谢紊乱在糖尿病患者发病过程中也非常明显[12].糖尿病大鼠胰岛素降糖功能下降，所以钙元素在组织与血液中的含量减少，但实验中大鼠血液中钙含量未出现明显下降，其原因与骨钙动员结果相关.如果血糖病情长期控制欠佳，即会导致钙流失，最终则引起骨质疏松.

2.5 Fe元素在各组织及体液中的变化

如图5所示，高脂高糖组大鼠及损伤组大鼠肝、肾、心、胰组织及血液中Fe2+的含量较空白组明显降低，差异具有统计学意义(p<0.05,p<0.01,p<0.001),而尿液中铁元素含量极低，无法得到有效数据，推测铁元素经由尿液排泄量极少，没有具有统计学意义的数据.

(a)Fe元素在各组织中的含量

铁元素在氧气运输和储存方面有着重要作用，体内铁元素缺乏所导致的氧气含量降低，使得有氧氧化进程受阻，影响TCA循环，糖异生及其他营养物质的代谢[13,14]；同时氧气含量低使胰岛素分泌合成受阻，影响血糖稳定.

3 结论

糖尿病是一种内分泌紊乱引起的疾病，其发病机理尚不明确，已有研究表明微量元素与糖尿病发生存在一定关系.本实验通过以高脂高糖饮食加链脲佐菌素诱导的2型糖尿病大鼠模型为研究对象，分析2型糖尿病大鼠模型肝、肾、心、胰组织及血、尿液中的必需元素含量，探讨其变化规律，发现糖尿病组大鼠肝、肾、心、胰组织及血清中Zn2+、Mg2+、Ca2+、Fe2+的含量显著减少，Cu2+的含量显著增加.同样也发现糖尿病组大鼠尿液中Zn2+、Cu2+、Mg2+、Ca2+、Fe2+的含量显著增加.因此高脂高糖联合STZ能够加速体内五种元素的紊乱，促进2型糖尿病的发生.

研究表明体内铜增多导致大量锌元素丢失，锌元素不仅可以调节胰岛素的降糖作用，同时也可提高胰岛素的稳定性，锌的含量可直接影响胰岛素的合成与活性.当体内缺锌时，胰岛素原有的转化率降低，使体液中胰岛素水平降低，血糖浓度升高，两种元素的紊乱更进一步加重糖尿病的病情；钙通量的改变可能会影响β细胞分泌功能，使胰岛素释放异常，胞浆钙稳态变化将导致2型糖尿病的发生；镁含量低会影响胰岛α细胞释放增高胰高血糖素，从而导致血糖升高；铁元素的缺乏会产生过多自由基，增强氧化应激，促进糖尿病的发生.

综上所述，糖尿病患者的必需元素代谢紊乱与糖尿病的发生与发展存在着一定的关系[15]，必需微量元素水平的慢性改变可能促进与长期糖尿病相关的继发并发症的发展.因此调节必需微量元素，有助于对糖尿病的预防和治疗.