胶原蛋白肽的制备

李艳莉

摘要    为了获取分子量较小、皮肤角质层易吸收的胶原蛋白肽，本文以新鲜猪皮为原料，用碱性蛋白酶水解方法制备胶原蛋白肽。结果表明，通过提取制备的猪皮胶原蛋白肽样品显示为淡黄色，而且猪皮的应用效率较高。

关键词    猪皮;胶原蛋白肽;制备方法

中图分类号    TS251.92        文献标识码    A        文章编號   1007-5739（2019）06-0220-01

猪皮，又名猪肤，东汉名医张仲景在《伤寒论》中曾详细记载了猪皮具有活血止血、补益精血、滋润肌肤、光泽头发、减少皱纹、延缓衰老的作用。猪皮中的蛋白质含量比较高，可以达到33%，其中胶原蛋白含量占总蛋白量的87.8%[1]。胶原蛋白由于特殊复杂的空间结构，其分子量高达300 kDa[2]，很难被机体吸收，通过蛋白酶水解可以将猪皮中的蛋白质水解为肽，其反应温和，产品安全，适用于功能食品、化妆品及其他健康相关产品[3]。同时，胶原蛋白的化学组成、结构赋予了其独特的生理活性，可发挥美白、保湿、防皱、修复、营养、减肥等美容美体作用[4]。胶原蛋白经水解后，其功能特性和生理活性功能将会被改善。胶原蛋白水解产物分子量的分布、疏水性的大小、极性的强弱等主要受水解过程的影响，从而影响胶原蛋白肽的活性功能[5]。研究表明，胶原蛋白肽的分子量一般在1～3 kDa时，其抗氧化活性、抑制皮肤黑色素生成、延缓皮肤老化和抑制紫外线损伤等功效是比较显著的[6]。

我国猪皮生物资源极为丰富，本研究以新鲜猪皮为原料，采用碱性蛋白酶酶解法提取分子量相对较小、皮肤角质层易吸收的胶原蛋白肽，并验证其对皮肤的美容保湿等功效。

1    材料与方法

1.1    试验材料

猪皮，购于杨凌好又多雨润专卖店。

1.2    试剂与仪器

试剂：碱性蛋白酶（8 500 u/g）为还原型谷胱甘肽，购于美国sigma公司;食用碱面（食品级）;三氯乙酸、氯化钠，均为分析纯。

仪器：UV-2450型紫外可见分光光度计（日本岛津仪器有限公司）;RE-52AA型旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）;SHB-Ⅲ型循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）;H1650型离心机（湖南湘仪离心机仪器有限公司）;HH-S4型电热恒温水浴锅（北京科伟永兴仪器有限公司）。

1.3    试验方法

1.3.1    胶原蛋白肽的提取。提取流程：新鲜猪皮→剔脂→洗涤→切碎→回流→酶水解→灭酶活→离心分离→真空抽滤→蒸发浓缩→胶原蛋白肽浓缩液。具体操作步骤：①选取皮下脂肪含量少、皮质较透明的新鲜猪皮作为原料，将猪皮去污，刮去毛根，剔除皮下脂肪，切成3 mm×3 mm左右的小块，用40 ℃的蒸馏水清洗2次。②将处理后的猪皮装于锥形瓶中加入2%NaCl（猪皮与2% NaCl的质量体积比为1∶8），于常温下放置8 h，取出猪皮中的杂蛋白。③按猪皮重量的7倍加入蒸馏水，升温至100 ℃回流蒸煮1 h。④将回流后的猪皮加液体冷却至55 ℃，加入0.2%食用碱面调节pH值为7.5，加入猪皮重量3%的碱性蛋白酶，放入恒温水浴锅中酶解12 h。⑤酶解完成后，将其放入95 ℃的恒温水浴锅中保持15 min以上，将酶灭活。⑥冷却后，液体离心20 min 4 000 r/min，分离脂肪层及未酶解的猪皮。⑦将酶解液真空抽滤，用旋转蒸发器50 ℃浓缩以得到猪皮胶原蛋白肽浓缩液，浓缩至原液体积的1/3。⑧将猪皮胶原蛋白肽浓缩液放于-20 ℃的冰箱中储藏备用。

1.3.2    GSSH标准液的制备。称取100 mg GSSH，用蒸馏水在100 mL容量瓶中溶解并定容至刻度。然后移取0、3、4、5、6、7、8 mL上述溶液于10 mL具塞试管中，分别用5%的TCA定容至刻度。此标准溶液的GSSH质量浓度分别是0、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 mg/mL。

1.3.3    GSSH标准曲线的绘制。分别移取标准液6 mL于10 mL离心管中，再分别加入4 mL双缩脲试剂，充分混匀。静置20 min，2 000 r/min离心10 min，于540 nm下测定ABS值。

1.3.4    胶原蛋白肽含量的测定。取2.0 mL样品溶液，加入等量10% TCA溶液，将其混合均匀（稀释2倍），静置10 min，4 000 r/min离心15 min，吸取上清液0.5 mL至10 mL容量瓶中，并用5% TCA定容至刻度（稀释20倍），充分摇匀，然后取6.0 mL上述溶液于另一试管中（3次重复），加入双缩脲试剂4.0 mL，混合均匀，静置20 min，2 000 r/min离心10 min，在540 nm下测定ABS值，以GSSH质量浓度为0 mg/mL的处理作空白对照，对照GSSH质量浓度-ABS值标准曲线，求得样品溶液中的多肽浓度，再乘以稀释倍数（共稀释40倍），即可求得样品的多肽含量。

2    结果与分析

通过标准曲线法测定酶解液中肽的浓度，由图1可知，其回归方程为y=9.161 8x，相关系数R2=0.995 1。按上述方程计算猪皮酶解液中胶原蛋白肽的浓度为88.68 mg/mL。

3    结论

本试验制得的猪皮胶原蛋白肽样品为淡黄色，经碱性蛋白酶在55 ℃酶解12 h后，猪皮基本消失，猪皮的应用效率较高。通过GSSH曲线的绘制，测定猪皮酶解液中胶原蛋白肽的浓度为88.68 mg/mL。所制得的胶原蛋白肽样品用三氯乙酸来沉淀蛋白，经离心，未发现蛋白沉淀，说明制得的胶原蛋白肽分子量相对较小，达到了本试验对胶原蛋白肽的要求。

4    参考文献

[1] 胥彩云，童军茂，周晓宏.胰酶水解猪皮胶原蛋白及其产物氨基酸分析[J].食品研究与开发，2010，3l（9）：34-36.

[2] 臧盛，张立娟，卢进峰.猪皮胶原蛋白的研究进展[J].农产品加工，2011（11）：59-62.

[3] 李开雄，赵志远，刘霞.猪皮中胶原蛋白的提取及其应用[J].肉类研究，1996（4）：43-48.

[4] 李国英.胶原、明胶和水解胶原蛋白的性能差异[J].四川大学学报（工程科学版），2005，37（4）：54-58.

[5] 冯成利，党蕊叶，冯慧，等.胰蛋白酶水解鲜猪皮的条件选择[J].陕西科技大学学报（自然科学版），2012，30（3）：23-25.

[6] 项智锋，谢红兵.不同酶法对猪皮中提取胶原蛋白的紫外线吸收对比分析[J].光谱实验室，2008，25（6）：1249-1253.