时间分辨荧光免疫层析法检测酥油中黄曲霉毒素M1的研究

魏 娜，张飞龙

(西藏农牧科学院农业质量标准与检测研究所， 西藏 拉萨 850032)

黄曲霉毒素主要是黄曲霉菌和寄生曲霉菌的代谢产物，毒性是氰化钾的 10 倍，是人类癌症的一个重要的致癌源，被世界卫生组织的癌症研究机构定为Ⅰ类致癌物[1]。黄曲霉毒素广泛存在于粮油农产品及其制品中，至今已分离出的黄曲霉毒素及其衍生物有20多种，而黄曲霉毒素M1作为其中的一种，主要存在于牛乳中[2-3]。 西藏酥油是从高原地区牦牛牛奶中提炼出来的油脂产品，是西藏高原地区牧民摄入脂肪的主要膳食途径之一[4-5]。酥油主要含有脂肪、水分及少量蛋白质，其中水分含量高达15 %左右，丰富的营养物质和较高的水分含量为微生物的滋生与繁殖创造了非 常适宜的环境条件，若储藏条件不佳，便会导致酥油中霉菌的大量繁殖，产生真菌毒素，严重影响酥油品质及其安全性[6]。刘晓棠、达娃卓玛、王秋玲等对西藏酥油中微生物的污染进行了评价，发现西藏地区酥油样品霉菌检出率为90 %以上[7-9]。由于仪器设备及检测技术的限制，目前鲜有对西藏酥油中真菌毒素含量研究报道。黄曲霉毒素最常用的检测方法是高效液相色谱分析法，虽然精确度高，但设备昂贵、操作繁琐、耗时长、检测成本高。时间分辨免疫荧光免疫层析(time-resolved fluorescence immunochromatography，TRFIA)，是近些年来得到发展应用的一种免疫分析技术，具有灵敏度高、检测速度快、结果稳定等优点，该技术目前已在食品安全检测领域得到应用[10-14]。因此本研究采用时间分辨荧光免疫分析仪测定酥油中黄曲霉毒素M1含量，以期为西藏酥油产品的质量安全、科学监管与防控提供重要检测手段。

表1 酥油样品中精密度与加标回收率

1 材料与方法

1.1 检测原理

采用竞争免疫层析原理定量检测乳制品中黄曲霉毒素M1含量：在检测试纸条上固化了黄曲霉毒素M1抗原和质控抗体；在冻干品中包含有时间分辨荧光素标记的黄曲霉毒素M1抗体和质控抗原，当在冻干品中加入含有黄曲霉毒素M1的样品后，时间分辨荧光素标记的黄曲霉毒素M1抗体发生化学反应生成复合物，插入试纸条后，该复合物会随样品层析到T检测区域而不与T线的抗原结合，样品黄曲霉毒素M1含量越高，T区域结合越弱。冻干品中的质控抗原与C线位置的质控抗体直接结合。

1.2 仪器

时间分辨荧光免疫分析仪、K30加热器、高效液相色谱仪。

1.3 检测方法

前处理。称取1～2 g样品(精确到0.001 g，被称试样中含黄曲霉毒素AFM1<8 ng)于50 mL离心管，加入8 mL石油醚，待酥油溶解后加入9 mL水和11 mL甲醇，振荡30 min，将全部液体移至分液漏斗中。加入0.3 g氯化钠摇动溶解，静置分层后，将下层转移到圆底烧瓶中，旋转蒸发至10 mL以下，用PBS稀释至30 mL。

时间分辨荧光免疫层析法。将待测样品及检测试纸、冻干品回复至室温。打开样品杯，加入150 μl待测样品，充分溶解、混匀，置加热器37 ℃温育，取出检测试纸条，插入加热器上的样品杯中，孵育6 min后，取出试纸条吸干下端液体，3 min内放入时间分辨荧光免疫分析仪中读取结果，当 AFM1含量过高，超出检测卡的检测范围(2.0 μg/kg)时，需将样品进行一定比例稀释后进行检测。

免疫亲和柱净化-HPLC法。按照《食品安全国家标准 食品中黄曲霉毒素M族的测定》(GB 5009.24-2016)第二法 高效液相色谱法测定。C18色谱柱(4.6 mm×150 mm ×5 μm)；进样量50 μl；柱温40 ℃；流动相为乙腈-甲醇(1∶1)和水，梯度洗脱，流速为1.0 mL/min；荧光检测器激发波长360 nm，发射波长440 nm。

2 结果与分析

2.1 方法的准确度和精密度

根据黄曲霉毒素定量检测卡的定量范围0～2.0 μg/kg，分别添加 AFM1标准溶液于阴性酥油样品中，使其在样品中的最终含量为 0.05、0.1、0.2、0.5、1.0 μg/kg，并进行5次重复试验。表1可知，该方法测定不同样品中AFM1的回收率在 77.6 %～89.6 %之间，样品的重复测定结果RSD为6.12 %～14.06 %。说明该检测技术具有较好的准确度和精密度。

2.2 黄曲霉毒素时间分辨荧光免疫层析检测实际样品与HPLC检测结果比对

选取5份酥油样品，分别采用时间分辨荧光免疫分析法和《食品安全国家标准.食品中黄曲霉毒素M族的测定》(GB 5009.24-2016，第二法 高效液相色谱法)进行比对，进一步考察验证方法的科学性和适用性。由表2可知，时间分辨荧光免疫分析法与免疫亲和柱净化-HPLC法测定结果的相对误差小于10 %，能满足酥油产品中黄曲霉毒素M1快速筛查的测定准确度的要求。与国标方法免疫亲和柱净化-HPLC法相比，该方法具有操作简便、时间短、灵敏度高、不用接触毒素标准品、有机试剂用量少、对环境及检验人员安全性最高等优点，适用于企业和质检机构对粮油农产品中 AFM1进行现场筛查。

3 结 论

本文利用高效液相色谱法和时间分辨荧光免疫层析法进行酥油中黄曲霉毒M1检测的对比研究。采用时间分辨荧光免疫层析法检测其回收率为77.6 %～89.6 %，变异系数为6.12 %～14.05 %，与 HPLC法相比，检测结果无显著性差异，相对误差小于12 %。时间分辨荧光免疫层析法检测过程中避免使用黄曲霉毒素标准品，可以直接读取检测结果，且所需时间短，检测全过程控制10 min内，仪器便于携带，可实现在农贸市场和超市等现场实地的快速检测，为酥油样品中黄曲霉毒素的快速检测提供了一种新的模式。

表2 时间分辨荧光免疫层析法与高效液相色谱法检测结果比较