拉萨白鸡PMEL17基因第10外显子序列突变的研究

2019-07-03石海仁郑晓彤马雪英

西藏农业科技 2019年4期

冯静，石海仁，鹏达，郑晓彤，张浩，马雪英*

(1.西藏自治区农牧科学院畜牧兽医研究所，西藏拉萨 850009；2.中国农业大学动物科学技术学院，北京 100094)

拉萨白鸡是以白来航鸡为父本、河谷藏鸡为母本杂交培育的良种蛋鸡，属轻型蛋用品系[1]。

显性白羽基因座是影响鸡羽色的一个重要基因座位，该基因座位上的显性等位基因 I 对色素沉着，尤其是真黑色素的合成有抑制作用[2]。黑素小体是黑色素细胞和视黄醛色素上皮细胞中特殊的溶酶体相关的细胞器[3]。目前在该基因座共发现4种等位基因：I (显性白羽)， I*S(Smoky，烟灰色羽色)，I*D (Dun，暗褐色羽色)，i(野生型)。Kerje等[4]对红色原鸡、白来航等不同品种鸡的DNA的PMEL17基因序列的第10外显子上的9 bp插入突变是显性白羽性状形成的主要原因，所对应的等位基因为I，而隐性等位基因i不含该突变，由此可见，鸡的PMEL17基因编码区的插入或缺失突变与这些等位基因形成有关。鸡的PMEL17 基因包括12个外显子，全长约 4.0 kb，共编码约788个氨基酸(GenBank 登录号：AY636127.1)。该基因编码一种黑素细胞特异性蛋白，这种存在于前黑素体基质中的蛋白对黑色素聚积以及黑素细胞的正常发育起着重要作用[5]。前黑素小体蛋白(Premelanosome protein，PMEL)又称PMEL17、silver[6]，由Sliver基因编码，主要在皮肤黑色素细胞、视网膜色素上皮细胞和眼色素层黑素细胞中进行表达，是黑素小体发育过程中的重要物质[7-8]。

关于拉萨白鸡显性白羽PMEL17第10外显子序列突变的研究，目前尚未研究。本试验首次对拉萨白鸡的显性白羽基因PMEL17第10外显子序列突变进行了分析，为拉萨白鸡今后的羽毛性状的功能基因的研究提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

选用5世代22周龄的拉萨白鸡228羽作为试验材料，其中花羽公鸡8羽，花羽母鸡36羽，白羽公鸡71羽，白羽母鸡113羽(表1)，是由西藏自治区农牧科学院畜牧兽医研究所蔡功堂乡拉萨白鸡养殖基地提供。

1.2 试验方法

1.2.1 血液采集和DNA的提取采用翅静脉采血1.5 ～2.0 mL，并且加入同等量的无水乙醇，混匀，常温保存。利用DNA血液提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)提取基因组DNA，用NanoDrop 2000C超微量分光光度计检测其核酸的浓度及其纯度。

1.2.2 引物设计根据鸡的PMEL17 基因第10外显子存在9 bp插入突变与显性白羽基因有关，GenBank 登录号：AY636127.1，设计引物：上游5’-AACGGCAACGGCTTGGCTGTGG-3’，下游5’-CCGGTAGGTGTAGGCAGCGGTG-3’[9]。

1.2.3 试验试剂及试验仪器 DNA血液提取试剂盒、Taq酶(配套10×TaqBuffer，25 mmol/L Mg2+)、dNTP均为天根生化科技(北京)有限公司；NanoDrop 2000C超微量分光光度计为美国(赛默飞)、DM2000 Marker为汇天东方科技有限公司；BsrB I内切酶、2 mL 10×NEBuffer(内切酶配套)为NEB公司；PCR仪为BIO-RAD；电泳仪为北京六一仪器厂；UVP凝胶成像仪为BIO-RAD。

表1 不同羽色的拉萨白鸡数量

M：D2000，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11泳道为PCR扩增产物片段。片段长度为217 bp或226 bp图1 拉萨白鸡PMEL17 基因第10外显子PCR的凝胶图

1.2.4 PCR扩增体系及反应条件 PCR扩增体系：反应体积为20 μl，2×TaqPCR masterMix 10 μl，10 pmol/L上游引物0.3 μl，10 pmol/L下游引物0.3 μl，40～50 ng/μl DNA 1.0 μl，加超纯水至20 μl。

PCR反应条件：95 ℃预变形5 min，95 ℃ 30 s，67 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸30 s，34个循环，72 ℃终延伸7 min，12 ℃保存，最终反应产物4℃冰箱保存。

1.2.5 RFLP酶切体系及反应条件 RFLP酶切体系：反应体积为20 mL，PCR反应产物10 mL，0.5 mLBsrBI内切酶，2 mL 10×NEBuffer(内切酶配套)，1 μl 2.5 mM的MgCl2，最后加超纯水至20 μl。

RFLP反应条件：将上述RFLP酶切反应体系加好后，充分混匀后，短暂离心，然后将其放入37 ℃的恒温箱内反应4 h即可。

M：D2000，1、3泳道为ii基因型；2、5、9、10泳道为II基因型；4、6、7、8、11、12泳道为Ii基因型图2 拉萨白鸡PMEL17 基因第10外显子PCE-RFLP的凝胶图

表2 拉萨白鸡PMEL17基因突变位点的基因型及其基因型频率分布

2 结果与分析

3种基因型的检测结果为：花羽公鸡II基因型有1羽，基因型频率为0.0044，Ii基因型有0羽，基因型频率为0.0000，ii基因型有7羽，基因型频率为0.0307；花羽母鸡II基因型有1羽，基因型频率为0.0044，Ii基因型有44羽，基因型频率为0.0219，ii基因型有17羽，基因型频率为0.1316；白羽公鸡II基因型有10羽，基因型频率为0.0439，Ii基因型有44羽，基因型频率为0.1930，ii基因型有17羽，基因型频率为0.0745；白羽母鸡II基因型有19羽，基因型频率为0.0833，Ii基因型有78羽，基因型频率为0.3421，ii基因型有16羽，基因型频率为0.0702；总的II基因型有31羽，基因型频率为0.1360，Ii基因型有127羽基因型频率为0.5570，ii基因型有70羽，基因型频率为0.3070(表2)。

本试验是通过对780羽母鸡、161羽公鸡翅静脉采血，提取DNA，然后通过PCR-RFLP技术对其分析，最后将含有Ii基因型和ii基因型的母鸡60羽和含有Ii基因型和ii基因型的9羽公鸡组群，将其种蛋进行孵化试验，在22周龄的时候，将其最后所得的228羽拉萨白鸡进行翅静脉采血，通过PCR-RFLP技术对其分析，结果表明：Ii基因型的最多，有127羽，Ii基因型频率为0.5570，其中花羽公鸡不含有Ii基因型，花羽母鸡含有5羽Ii基因型，其基因型频率为0.0219，白羽公鸡含有44羽Ii基因型，其基因型频率为0.1930，白羽母鸡含有Ii基因型78羽，其基因型频率为0.3412；ii基因型的有70羽，位居第二，ii基因型频率为0.3070，其中花羽公鸡有7羽ii基因型，其基因型频率为0.0307，花羽母鸡含有30羽ii基因型，其基因型频率为0.1316，白羽公鸡含有17羽ii基因型，其基因型频率为0.0745，白羽母鸡含有ii基因型16羽，其基因型频率为0.0702；II基因型的含量最少，有31羽，基因型频率为0.1360，其中花羽公鸡含有1羽II基因型，其基因型频率为0.0044，花羽母鸡含有1羽II基因型，其基因型频率为0.0044，白羽公鸡含有10羽II基因型，其基因型频率为0.0439，白羽母鸡含有19羽II基因型，其基因型频率为0.0833。

本研究采用PCR-RFLP技术分析拉萨白鸡的基因组DNA的PMEL17基因序列的第10外显子上是否存在9 bp的插入，发现(图1～2)PMEL17基因序列的第10外显子存在9 bp插入突变时，扩增目的片段长度为184和42 bp，为II基因型纯合子的个体，且为显性白羽纯合个体；PMEL17基因序列的第10外显子存在9 bp插入突变，且扩增目的片段长度为217，184和42 bp，为Ii基因型的杂合的个体，且为显性白羽杂合个体；PMEL17基因序列的第10外显子不存在9 bp插入突变，且扩增目的片段长度为217 bp，为ii基因型，且为非显性白羽个体。

3 讨论

在本试验中，其显性白羽杂合个体最多，为127羽，基本符合Ii基因型个体占总个体数(228羽)的1/2，非显性白羽基因ii的个体为70羽，基本符合ii基因型个体占总个体数(228羽)的1/4。在此研究基础上，根据实际需要，将其II基因型的个体单独组群，就可以得到显性白羽纯合个体；也可以将Ii显性杂合个体和ii非显性白羽个体组群，从而挑选出我们所需要的基因型；也可以将ii基因型单独组群，从而得到花色羽的个体。

动物毛色的形成过程与黑色素的产生和沉淀关系紧密，超过127个基因影响毛色的形成过程[10]，但大多数基因是控制黑色素合成或作用于黑色素合成的通路上。动物毛色和羽色一直是育种工作者关注的重要性状，主要受到动物体内黑色素产生和沉积的影响，是多个基因共同作用的结果。黑色素的产生和沉积主要发生在黑素小体的淀粉样纤维结构上[11-13]，PMEL17基因所编码的前黑素小体蛋白是这一过程所不可或缺的。本研究与Kerje等[4]发现，PMEL17基因在第10外显子上9 bp的插入是鸡显性白性状的主要原因，揭示了鸡显性白性状的分子作用、Berson等[5]报道的鸡PMEL基因编码一种黑色素细胞特异性蛋白，这种存在于前黑素体基质重的蛋白对黑色素聚集以及黑素细胞正常发育起作用、Martinez等[14]报道的小鼠silv基因的突变导致体内黑色素细胞的丢失，从而使得毛色变为银灰色、Menottiraymond等[15]报道的在家猫上，SILVER位点的突变同样对黑色素的产物存在着一定的影响、李蓓等[16]报道的马的银灰色被毛与PMEL基因多态性紧密相关、刘小军等[17]报道的坝上长尾鸡PMEL17基因是影响羽色形成的重要基因，通过和其他基因互作对皮肤毛色形成以及其他组织色素形成均有作用、姚文成等[18]报道的PMEL17基因的多态性与鸭羽毛性状具有一定的关联性相一致。