菊科4种植物萃取物对核桃病原真菌的抑菌活性研究

冯小飞 王紫雯 熊建辉 刘桂芹 陈玉惠 马建鹏

( 1. 西南林业大学生命科学学院，云南 昆明 650233；2. 云南省曲靖市林业局，云南 曲靖 655000；3. 曲靖市面店坡联营林场 云南 曲靖 655000；4. 大理州林业有害生物防治检疫局，云南 大理671000)

核桃（Juglans regia），又称胡桃，为胡桃科核桃属植物，多年生落叶乔木，是国内外广泛栽培的坚果树种之一[1]，因其营养价值和保健功效较高而被称为“智力果”、“长寿果”[2-3]。我国是世界上主要的核桃种植、生产和消费国，其中云南省核桃栽培历史悠久，品种丰富[4-5]。随着核桃相关产品的开发，种植规模日渐扩大，集约化栽培，田地间侵染病原菌多、管理水平不到位等因素，导致了近些年云南核桃种植地区病害发生严重，严重影响了核桃品质和产量，极大的损害和降低了种植户的收益[6-7]。菊科（Asteraceae）植物种类多，适应性强，分布范围广[8-9]。其中千里光（Senecio scandens）、苦荬（Ixeris denticulata)等本土菊科植物在民间有着悠久药用历史，含有的萜类、黄酮、生物碱等多种化合物具有杀虫、抑菌、细胞毒素等活性[10-11]，是一类具有应用价值和开发潜力的植物源农药材料[12-13]。云南地区菊科植物资源丰富，加强对本土菊科植物利用的同时，也应该关注外来入侵菊科植物的研究、利用和开发。小飞蓬（Conyza canadensis）、波斯菊（Cosmos bipinnata）等菊科外来入侵植物已经对当地的农业生产和生态环境造成了一定的影响，通过本次实验，开展菊科植物在核桃病原真菌抑菌活性方面的研究，发掘菊科植物在植物源抑菌药物方面的潜能，同时促进外来入侵菊科植物的

防治[14-15] 。

本研究以云南省多个核桃主要种植地区的病害调查结果为依据，对引起核桃枝枯的主要病原菌以及造成果实和叶部病害的病原菌开展抑菌活性研究。利用4种不同的菊科植物提取物为实验材料，对5种病原真菌开展抑菌实验，筛选出具有抑菌活性的菊科植物，为5种核桃病原菌的防治及植物抑菌农药的开发提供参考依据[16-17]。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 菊科植物材料来源

千里光、波斯菊、小飞蓬、苦荬采自西南林业大学校园内，选择生长状况良好的菊科4种植物地上部分，室内阴干备用。

1.1.2 供试菌株来源

供试菌株为壳梭孢（Fusicoccum persicae）、壳二孢（Ascochytasp.）、拟茎点霉（Phomopsissp.）、胶孢炭疽（Colletotrichum gloeosporioides）、叶点霉（Phyllostictasp.），来源于西南林业大学，云南省高校森林有害生物科技创新团队前期从核桃树上分离所得，现保存于西南林业大学生命科学学院。

1.1.3 抑菌物质的萃取

菊科4种植物阴干后剪成小段（长1～2 cm），每种样品5 kg，用2倍体积的85%乙醇水溶液浸提3次，每次3 d。合并提取液，减压蒸馏得到菊科4种植物粗提物的浸膏。不同浸膏用2倍质量的蒸馏水溶解饱和后，分别用3倍体积的石油醚、乙酸乙酯对粗提物萃取3次，萃取后的有机试剂合并后经减压蒸馏浓缩后备用。

1.2 实验方法

1.2.1 萃取物抑菌母液的配制

实验采用抑菌培养基对5种核桃病原菌进行抑菌活性研究，抑菌培养基的质量浓度分别为0.0、0.5、1.5、2.5、5.0 mg/mL。按照总体积150 mL的抑菌培养基计算，分别称取一定质量的千里光、波斯菊、小飞蓬、苦荬萃取物于25 mL小三角瓶中，用10 mL 85%的乙醇水溶液充分溶解，溶解后的萃取物抑菌溶液放入无菌台中，紫外灯灭菌30 min后做为抑菌母液备用。

1.2.2 抑菌培养基的制备

灭菌后的PDA培养基在无菌台中冷却至50 ℃左右，将紫外灭菌后的萃取物液添加到PDA培养基中，充分混匀后倒入培养皿（直接9 cm），每皿20 mL，按照不同的浓度梯度配制成不同的抑菌培养基冷却后备用，同时对照培养基中加入相同体积的85%乙醇水溶液，每个浓度3个平行实验[18]。

1.2.3 抑菌实验

采用生长速率法[19]测定不同浓度的菊科4种植物萃取物对5种核桃病原菌菌丝体生长的抑制作用。在无菌台中将病原菌种制成菌碟（直径0.5 cm）后接种到抑菌培养基质的中央，以未添加抑菌物质的培养基为CK进行接种。接种后的培养皿至于25 ℃的恒温培养箱中培养，观察5种核桃病原真菌在不同培养基上的萌发情况及菌丝体生长情况。通过十字交叉法[20]每2 d对不同病原菌菌丝体的生长速率进行测量，待对照菌丝体长满培养皿边缘，结束测量试验，并按公式（1）计算抑菌率（X）[21-22]。

式中，D1为CK菌落直径，D2为处理组菌落直径。

1.3 数据处理

以SPSS 19软件中Duncan方法对实验结果数据进行单因素分析，同时进行各组处理数据间的显著性分析和比较。

以SPSS 19软件开展毒力回归方程的模拟和半抑制率（EC50）的计算。抑菌率、浓度、总数为变量，以软件回归分析中的Probit过程进行10为对数底的logit模型转换，计算出不同抑菌物质的EC50值；参数估计值中的PROBIT模型即为不同抑菌物质的毒力回归方程。

2 结果与分析

2.1 不同质量浓度3种萃取物对核桃病源菌株的抑菌效果

由表1可知，菊科植物萃取物对供试的5株核桃病原真菌菌丝体生长都表现出了一定的抑制效果，随着浓度的增加，抑制作用逐渐增强，且较高浓度（5.0 mg/mL）与低浓度（0.5 mg/mL）时对病原真菌的抑制效果差异显著（P＜0.05）。不同菊科植物的石油醚萃取物对核桃病原菌的抑制效果不同，小飞蓬石油醚萃取物对壳梭孢、壳二孢、炭疽菌的抑制效果较好，最高抑制率分别达到了77.5%、81.6%、79.5%，与相同浓度的石油醚萃取物相比抑制率差异显著（P＜0.05）。波斯菊萃取物对上述3种病原菌的抑制效果次之，相同浓度时的抑制率分别达到了66.1%、63.9%、70.5%，低于小飞蓬石油醚萃取物的抑制率，但是显著高于苦荬和千里光萃取物（P＜0.05）。此外，波斯菊石油醚萃取物对拟茎点霉和叶点霉的抑制效果较好，最高抑制率分别达到了45.7%和74.1%，且抑制率差异显著（P＜0.05）。4种植物的石油醚萃取物对拟茎点霉病原菌的抑制效果最弱，最大浓度时的抑制率均小于46%。乙酸乙酯萃取物对供试的5种核桃病原真菌也表现出了不同的抑制效果，千里光的乙酸乙酯萃取物对供试病原菌的抑制效果较好，特别是对壳梭孢、叶点霉和炭疽3种病原菌，最大抑制率分别为68.8%、60.3%、70.3%，相同浓度条件下差异显著（P＜0.05）；小飞蓬乙酸乙酯萃取物对壳二孢和拟茎点霉的抑制效果较好，最大抑制率分别为59.1%、61.8%，高于其他菊科植物乙酸乙酯萃取物的抑制率，千里光萃取物的抑制效果次之，分别为54.6%、52.7%。

菊科4种植物的石油醚萃取物对5种供试核桃病原真菌的抑制效果总体较好，除了对拟茎点霉病原菌的抑制率较低，对其余4种病原菌的最大抑制率均超过了74%，最大达到了81.6%。乙酸乙酯萃取物对拟茎点霉病原菌抑制效果较好，最高抑制率达到了61.8%，相同条件下对对壳梭孢、壳二孢、叶点霉和炭疽病原菌的抑制效果均小于石油醚萃取物，最大抑制率为59%～70%。

表 1 菊科4种植物的萃取物对核桃病原真菌的抑制效果Table 1 Inhibition effect of extracts from 4 plant species of Asteraceae on J. regia pathogenic fungi

续表 1

2.2 不同萃取物对核桃病原真菌抑制率的毒力回归方程

利用SPSS 19软件对菊科4种植物对病原菌的抑制率进行毒力回归方程的模拟和建立[23]，同时结合卡方分布表，利用卡方检验对本次软件模拟的毒力回归方程进行拟合优度的检验，结果如表2所示。

由表2可知，χ2值均小于检验的临界值5.991（χ0.052）（自由度为2时），且P值均大于0.05，卡方（χ2）检验结果说明毒力回归方程拟合优度良好。

表 2 菊科4种植物的萃取物对核桃病原真菌毒力的回归方程Table 2 Regression equation of the extracts from 4 plant species of Asteraceae on the virulence of J. regia pathogenic fungi

续表 2

2.3 不同萃取物对核桃病原菌的EC50值

EC50值表示抑制率达到50%时添加的抑菌物的质量，EC50值的大小反应了不同抑菌物对病原菌的抑制能力，抑菌能力越强，EC50值越小。

2.3.1 菊科4种植物石油醚萃取物对核桃病原菌EC50值的影响

由图1～2可知，波斯菊的石油醚萃取物对5种病原菌的EC50值均较小，分别为0.63、1.72、6.78、0.56、0.05 mg/mL；苦荬石油醚萃取物对叶点霉EC50值为4.58 mg/mL，对其余4种病原菌的EC50值均大于12.0 mg/mL，最大达到了240.69 mg/mL；千里光石油醚萃取物对壳梭孢、壳二孢和叶点霉病原菌的EC50值均小于4.50 mg/mL，最小为1.42 mg/mL；小飞蓬石油醚萃取物对壳梭孢、壳二孢和炭疽菌的EC50值分别为1.31、1.34、0.71 mg/mL，对拟茎点霉和叶点霉的EC50值均大于13.0 mg/mL。

图 1 石油醚萃取物对壳梭孢、壳二孢、炭疽菌的抑制效果Fig. 1 Inhibitory effects of petroleum ether extracts on Fusicoccum persicae， Ascochyta sp.， and Colletotrichum gloeosporioides

图 2 菊科4种植物石油醚萃取物对5种病原菌EC50值的影响Fig. 2 Effects of petroleum ether extracts from 4 plant species of Asteraceae on EC50 values of 5 pathogens

2.3.2 菊科4种植物乙酸乙酯萃取物对核桃病原菌抑菌活性的影响

由图3可知，千里光的乙酸乙酯萃取物对5种病原菌的半抑制浓度均小于其他供试植物的EC50值，分别为0.26、2.05、3.96、1.95、0.68 mg/mL；波斯菊乙酸乙酯萃取物对壳二孢、叶点霉和炭疽菌的EC50值均小于4.5 mg/mL，对炭疽菌的EC50值最小达到了3.41 mg/mL；苦荬对炭疽菌的EC50值最小，为2.43 mg/mL，对其他4种病原菌的EC50值均超过了5.5 mg/mL，对壳二孢的半抑制率浓度最大，为38.9 mg/mL；小飞蓬乙酸乙酯萃取物对壳二孢、拟茎点霉和叶点霉的半抑制均较小，3种病原菌的EC50值都小于4.1 mg/mL，对炭疽菌的EC50值最大，为19.94 mg/mL。

图 3 菊科4种植物乙酸乙酯萃取物对5种病原菌EC50值的影响Fig. 3 Effects of ethyl acetate extracts from 4 plant species of Asteraceae on EC50 values of 5 pathogens

3 结论与讨论

实验结果表明，菊科4种植物的萃取物对供试的5种核桃病原真菌菌丝体生长都有一定的抑制作用，抑制效果与菊科植物种类、萃取所用有机溶剂和添加的抑菌物浓度有关。小飞蓬石油醚萃取物对壳梭孢、壳二孢和炭疽菌菌丝体的生长表现出了较好的抑制活性，最大抑制率分别达到了77.5%、81.6%、79.5%，EC50值分别为1.31、1.34、0.71 mg/mL。波斯菊石油醚萃取物对叶点霉菌丝体生长抑制效果较好，最大抑制率达到了74.1%，半抑制率浓度为0.56 mg/mL。小飞蓬乙酸乙酯萃取物对拟茎点霉病原菌抑制效果较好，最大抑制率达到了61.8%，半抑制率浓度为3.63 mg/mL。石油醚萃取物对供试病原真菌的抑制效果普遍较好，特别是对壳梭孢、壳二孢、叶点霉和炭疽，抑制率显著大于相同浓度的乙酸乙酯萃取物；除了对拟茎点霉外，乙酸乙酯萃取物对剩余病原菌的抑制效果均弱于相同条件下的石油醚萃取物，结合EC50值可知，不同萃取物对病原菌的抑制率大，其对应的萃取物EC50值均较小。

传统化学农药因残留重，难降解，对环境污染大等问题越来越不适用于无公害果蔬的生产。近年来，随着“安全农药”理念的提出，绿色、环保、高效、低毒的植物源农药成了研究和开发的热点。小飞蓬是西南地区主要菊科外来入侵物种之一，本研究发现，小飞蓬的萃取物对壳梭孢、壳二孢、拟茎点霉、炭疽菌4种核桃病原真菌的菌丝体生长都表现出了较好的抑制活性，说明该植物中含有的1种或者几种化合物对上述5种病原真菌的菌丝体生长造成一定的影响，阻碍其在培养基上的正常生长。本研究利用不同小飞蓬的萃取物对供试病原菌开展抑菌活性，因为萃取物中含有多个化合物，目前不能确定对病原菌的抑菌效果是植物体中单体化合物的独立效果还是多个化合物对病原菌的协同作用。后期将利用小飞蓬为材料，针对壳梭孢、壳二孢、拟茎点霉、炭疽菌等病原菌开展活性追踪，对抑菌效果较好的萃取物进行活性单体化合物的分离、结构鉴定和抑菌试验研究，进一步确定活性化合物的结构和种类，为菊科植物绿色抑菌农药的开发提供基础[24]。