黄芩苷在脂多糖(LPS)诱导的大鼠多器官急性损伤中的保护作用

汪 旭，张 鑫，马晓娟，郝雪琴

NOD样受体蛋白3 (nod-like receptor 3, NLRP3) 是一种多蛋白复合物，参与caspase-1依赖的白细胞介素IL-1样促炎细胞因子的释放。NLRP3通过组件组装成炎症小体结构激活，对损伤相关分子模式(damage-associated molecular patterns,DAMP)或病原体相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMP)的细胞内识别，进而结合ASC(apoptosis speck-like protein)导致caspase-1的招募和自切割活化，促进细胞因子前体IL-1α，pro-IL-1β，IL-33和pro-IL-18的成熟和分泌[1]。DAMPs是宿主生物分子，它能引起非感染性炎症反应。相反，PAMPs引起病原体感染性炎症反应。细菌脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是革兰氏阴性杆菌细胞膜上发现的内毒素，被认为是一种典型的PAMPs[2]。据报道，微生物感染引起caspase-1依赖的抗菌反应触发炎症小体复合物的组装[3]。黄芩苷(Baicalin,BA)具有抗氧化、抗焦虑作用，广泛用于治疗感染性和炎性疾病，可以预防急性肝损伤、实验性牙周炎和败血症[4]。本研究采用LPS诱导大鼠炎症反应，探讨黄芩苷对肾、睾丸、脑、肺急性损伤的保护作用。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料动物：40只Sprague-Dawley雄性大鼠购自华中科技大学同济医学院动物培养中心，动物许可证号：SCXK(鄂)2010-0007。试剂：IL-1β和IL-18 ELISA试剂盒(美国R&D Systems公司，RLB00)；免疫组化SABC检测试剂盒(SA1020)、NLRP3抗体(BA3677)、DAB试剂盒(武汉博士德生物有限公司，AR1022)。仪器：全波长酶标仪(美国伯腾仪器有限公司，Epoch)；轮转切片机(德国Leica公司，RM-2235)；Carl Zeiss显微镜(苏州卡尔蔡司有限公司，Axio Scope A1)。

1.2 分组、造模及给药动物在室温(24±1) ℃和12 h的黑暗条件下自由进食实验大鼠标准饲料和纯净水。适应2周后，40只大鼠随机分为5组，每组8只，分别为对照组、LPS组、黄芩苷40 mg组、黄芩苷80 mg组和黄芩苷160 mg组。LPS组大鼠第1、3、5 d腹腔注射LPS 0.79 mg·kg-1；黄芩苷组大鼠第1、3、5 d腹腔注射LPS 0.79 mg·kg-1，然后分别给予黄芩苷40、80和160 mg·kg-1，连续灌胃7 d；对照组大鼠灌胃生理盐水[5]。第12天采集样本。本研究得到河南科技大学当地动物伦理委员会的批准。

1.3 血清IL-1β和IL-18浓度的测量用戊巴比妥(40 mg·kg-1)麻醉大鼠。取腹主动脉血，置于室温30 min，然后3 000 r·min-1离心15 min，取上清。分别使用大鼠IL-1β和IL-18 ELISA试剂盒测量血清IL-1β和IL-18的浓度，使用酶标仪读取数据。

1.4 组织形态改变大鼠经0.9% NaCl和4%多聚甲醛全身灌注后，收集肾脏、睾丸、脑组织和肺组织，4%多聚甲醛溶液中浸泡48 h，脱水后石蜡包埋；4 μm组织切片进行HE染色，光镜下观察肾脏、睾丸、脑组织和肺组织的形态学变化。

1.5 NLRP3免疫组化肾、睾丸、脑和肺组织在4%多聚甲醛中浸泡24 h，石蜡包埋。切片(4 μm)在PBS中冲洗5 min，然后进行免疫组化染色，使用免疫组化过氧化物酶检测试剂盒检测。使用DAB试剂盒观察过氧化物酶活性。采用Image-pro plus软件定量计算每组图片中NLRP3蛋白的表达 (integral optical density,IOD)。

2 结果

2.1 黄芩苷对IL-18和IL-1β的影响LPS 组血清IL-1β和IL-18浓度高于对照组；黄芩苷40 mg组和黄芩苷80 mg组与LPS组相比无显著性差异；与LPS组相比，黄芩苷160 mg组血清IL-1β和IL-18浓度较低。黄芪苷治疗可减轻LPS诱导的大鼠血清IL-1β和IL-18浓度。见表1。

表1 黄芩苷对IL-18和IL-1β的影响

注：①与对照组相比较，P<0.05；②与LPS组相比较，P<0.05。

2.2 黄芩苷对大鼠肾脏形态学变化的影响与对照组相比，LPS组的肾小囊间隙增大，肾间质炎症细胞浸润；黄芩苷160 mg组肾小囊腔有所改善，肾间质未见明显炎症细胞浸润。黄芪苷治疗可减轻LPS诱导的肾形态学损伤。

2.3 黄芩苷对大鼠睾丸的影响与对照组相比，LPS组睾丸生精小管基底膜破坏，精原细胞与初级精母细胞之间的间隙增大，生精细胞的数量减少，排列不规则；黄芩苷160 mg组生精小管基底膜完整，生精细胞排列规则。黄芪苷治疗可以以剂量依赖性的方式缓解LPS诱导的睾丸损伤。

2.4 黄芩苷对大鼠脑的形态学变化的影响LPS组皮质神经元数量少于对照组，细胞排列混乱，无明显边界，在细胞核周围有很大的空泡，细胞核和细胞质染色较浅；黄芪苷80 mg组和160 mg组神经元细胞排列规则，脑细胞内未见明显大液泡。黄芩苷治疗可以以剂量依赖性的方式减轻LPS引起的脑损伤。

2.5 黄芩苷对大鼠肺的形态学变化的影响与对照组相比，LPS组肺泡壁肿胀、变厚，炎性细胞浸润，伴有间质组织充血、水肿；黄芩苷160 mg组肺泡壁无充血、水肿，未见明显炎细胞浸润。黄芩苷治疗可以剂量依赖性的方式缓解LPS诱导的肺损伤。

2.6 黄芩苷对NLRP3蛋白表达的影响NLRP3蛋白主要表达在肾小管上皮细胞的细胞质、睾丸的生殖细胞和精子的细胞核、大脑神经元的细胞质和肺泡上皮细胞的细胞质中。黄芩苷对大鼠各组织器官NLRP3蛋白表达的影响见表2。与对照组相比，LPS组肾、睾丸、脑、肺中NLRP3蛋白表达显著增加；黄芪苷(40、80或160 mg·kg-1)治疗可减少NLRP3蛋白在肾脏(图1)、睾丸(图2)、大脑(图3)和肺(图4)中的表达。

表2 黄芩苷对大鼠各组织器官NLRP3蛋白表达的影响

注：①与对照组相比较，P<0.05；与LPS组相比较，②P<0.05。

图1 黄芩苷减少LPS诱导的大鼠肾脏NLRP3蛋白的表达(SP，×400)

图2 黄芩苷减少LPS诱导的大鼠睾丸NLRP3蛋白的表达(SP，×400)

图3 黄芩苷减少LPS诱导的大鼠脑NLRP3蛋白的表达(SP，×400)

图4 黄芩苷减少LPS诱导的大鼠肺NLRP3蛋白的表达(SP，×400)

3 讨论

细菌脂多糖是革兰氏阴性杆菌细胞膜上发现的内毒素，细菌内毒素具有广泛的生物学活性，脂多糖是内毒素的毒性核心，也是细菌的主要致病因子。内毒素进入机体后，会对宿主细胞产生一定的毒性作用，引起机体多种急慢性炎症反应，对组织造成炎性损伤[6]。NLRP3在正常细胞中有表达，炎症刺激如LPS时激活，NLRP3炎性小体激活不当可导致多种疾病的进展[7-8]。新的研究表明，NLRP3炎性小体参与了肾脏炎症[9]、足细胞损伤和高同型半胱氨酸血症肾小球硬化的诱导[10]；NLRP3可抑制睾丸类固醇的生成，扰乱精子生成，导致睾丸功能障碍[11]；NLRP3的激活会导致LPS暴露动物的长期行为改变。NLRP3可直接或间接损伤肺泡上皮细胞和毛细血管内皮细胞[12]。

黄芩是一味常用的中药，它的有效部位是根部，黄芩的干燥根富含多种黄酮类化合物，可提取多种生物活性物质。黄芩苷是主要的活性成分，具有广泛的药理作用，黄芩苷具有抗氧化、抗炎作用[13-14]。研究表明，在副猪嗜血杆菌感染期间，黄芩苷呈剂量依赖性的方式抑制NLRP3炎症小体和NF-κB信号[8]，可防止大鼠的睾丸蒂扭转。黄芩苷可能通过抗炎和抗凋亡机制减轻缺血导致的神经元细胞损伤。黄芩苷降低血脑屏障通透性，有效降低脑出血后脑水肿[15]。研究表明，黄芩苷可能会降低IL-1β的水平，减轻缺血再灌注引起的肾损伤[4]。此外，黄芩苷还能减轻空气栓塞所致急性肺损伤[12]。

本研究在大鼠腹腔注射LPS后，LPS组血清IL-18，IL-1β水平高于对照组，肾、睾丸、脑、肺中NLRP3蛋白表达均高于对照组，LPS组肾小囊腔增大，睾丸生精细胞减少，脑细胞内大液泡、肺泡壁肿胀、增厚。表明由于LPS炎症刺激诱导的NLRP3在大鼠多个器官的表达，IL-1β和IL-18炎性因子的释放，导致大鼠多个器官急性损伤。可能是NLRP3的表达增强了大鼠多个器官的炎性作用，从而使组织发生明显的形态学损伤。

黄芩苷治疗后IL-1β和IL-18 细胞因子水平和各组织器官中NLRP3的水平呈剂量依赖性地下降，其中黄芩苷160 mg组血清IL-18、IL-1β水平和肾、睾丸、脑、肺中NLRP3水平明显低于LPS组。黄芩苷160 mg组肾间质未见明显炎细胞浸润，睾丸生精小管基底膜完整，脑细胞内未见大液泡，肺泡壁无明显肿胀。提示黄芪苷在多个器官中抑制NLRP3的表达，并减少caspase-1依赖的IL-1β和IL-18 细胞因子的释放，以及随后的炎症反应，减缓了炎症刺激引起的组织损伤作用，有效地减轻组织形态损伤及病理学改变。因此，可以得出结论，黄芩苷能保护大鼠肾脏、睾丸、脑和肺免受LPS诱导的急性损伤，其机制可能与抑制NLRP3的表达有关。