乙酰左旋肉碱对顺铂诱导的学习记忆损伤的神经保护作用

王晨莹，董晓辉，王 贝，王冬梅

化疗相关的认知障碍(chemotherapy-related cognitive impairment，CRCI)，也称化疗脑(chemo brain)，是在进行化疗药物治疗后出现的认知障碍，包括广泛的神经问题，如注意力、执行功能、记忆力和处理速度方面的障碍[1-2]。这些认知障碍通常会持续很长时间，并对生活质量产生负面影响[3-5]。研究显示，铂类化疗药物顺铂在临床的应用与CRCI的高发率密切相关。目前，大多数关于化疗脑的研究都集中在乳腺癌患者身上[6-7]。对于啮齿类动物的临床研究表明，通常用于乳腺癌的药物(如甲氨喋呤、5-氟尿嘧啶和环磷酰胺等)会引起认知障碍，这与神经炎症和神经发生障碍有关[8-10]。但化疗相关认知障碍的潜在机制尚不清楚，目前尚无有效的治疗方法。最近研究发现，化疗引起的大脑线粒体损伤在CRCI中发挥着关键性作用[11-12]。乙酰左旋肉碱具有线粒体和神经保护的作用[13-14]，本研究探讨乙酰左旋肉碱对顺铂诱导的学习记忆损伤的神经保护作用，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料实验动物：C57BL/6小鼠38只，体质量25～30 g。药品与试剂：顺铂(购自sigma公司)；乙酰左旋肉碱(上海TCI化成工业发展有限公司)；高尔基染色试剂盒购自美国Hitobiotec公司；尼氏染色试剂盒、线粒体—胞质蛋白制备试剂盒和线粒体膜电位检测试剂盒(碧云天生物技术公司)；线粒体ATP合成生物发光检测试剂盒、线粒体细胞色素c氧化酶活性测定试剂盒(美国GENMED SCINTIFICS INC生物公司)。仪器：MT-200 Morris水迷宫视频跟踪分析系统(荷兰Noldus公司Ethovision XT软件)。

1.2 分组与给药C57BL/6小鼠(25～30 g)38只随机分为4组(n=8～10)：对照组(Control组)，乙酰左旋肉碱单独组(Acetyl-L组)，化疗脑组(Cisplatin组)，乙酰左旋肉碱治疗化疗脑组(Cis/Acetyl-L)。连续5 d腹腔注射2.3 mg·kg-1顺铂，5 d不注射，为1个周期，连续进行3个周期构建化疗脑模型(Cisplatin组)，在顺铂注射1 h前腹腔注射乙酰左旋肉碱(150 mg·kg-1)进行治疗(Cis/Acetyl-L)。Control组腹腔注射等剂量的Cisplatin溶剂(无菌生理盐水)和腹腔注射乙酰左旋肉碱溶剂，Acetyl-L组腹腔注射等剂量的Cisplatin溶剂和腹腔注射乙酰左旋肉碱(150 mg·kg-1)。

1.3 检测指标

1.3.1 用Morris水迷宫实验检测学习和记忆功能平台隐藏实验中：每天在同一时间段训练小鼠4次，分别从4个不同象限将小鼠面壁置入池内，不同的小鼠在相同的位置下水。每次游泳时间60 s，找到平台，并在上面停留3 s以上者，视为找到平台；60 s内没有找到平台的要将其引导到平台上，停留15 s；小鼠没有找到平台按60 s计算潜伏期。每次训练间隔1 h左右。空间探索实验：第五天，把放置在第三象限的平台拿走，任选一个入水点将小鼠放入水中，小鼠在水中游泳60 s，主要记录小鼠在平台区出现的频次，小鼠在目标象限(原平台所在象限)和其他各象限的游泳时间，数据搜集和处理由Morris水迷宫系统软件完成。

1.3.2 用尼氏染色观察海马CA1区神经元形态行为学实验后，每组随机抽出3～4只小鼠进行形态学分析。用4%多聚甲醛心脏灌注取脑、固定、石蜡包埋，常规脱蜡至水。切片入尼氏染色液1(cresyl violet stain)，56 ℃浸染1 h，冷蒸馏水冲洗后，入尼氏染色液2(Nissl differentiation)分化1～3 min，至显微镜下观察至背景接近于无色为止。随后无水乙醇迅速脱水。二甲苯透明，中性树胶封固。显微镜下观察海马CA1区神经元形态，并拍照。

1.3.3 用高尔基染色观察树突棘密度行为学实验后，每组随机抽出2～3只小鼠，迅速取出脑组织，严格按照高尔基染色试剂盒说明书进行浸泡、包埋、切片(厚度80 μm)、染色、脱水、透明、封片、观察结果。

1.3.4 线粒体分离和功能检测颈椎脱臼法牺牲小鼠后，剥离的海马置于预冷的生理盐水冲洗，线粒体分离具体方法参照文献[8]。细胞色素C氧化酶活性以还原型细胞色素C(Cyt C)在550 nm，下被氧化的速度，以变化的吸光度值表示细胞色素C氧化酶活性。提取的线粒体与外源底物谷氨酸钾及ADP孵育，采用荧光法检测ATP产生速率。线粒体膜电位(mΔΨ)：线粒体悬液中加入含2 μM JC-1的检测体系中，微型转子搅拌下室温孵育30 min，离心去除未结合线粒体的JC-1，488 nm激发光下读取荧光强度。

2 结果

2.1 Morris水迷宫

预实验中选择了低中高3个不同的剂量(50、100、150 mg·kg-1·d-1)作用化疗脑(Cisplatin组)小鼠，通过行为学确定乙酰左旋肉碱的最佳剂量。结果显示，只有高剂量(150 mg·kg-1·d-1)乙酰左旋肉碱，治疗后均能显著改善化疗脑组小鼠的认知能力(表现为与化疗脑组小鼠相比，空间探索实验中靶象限滞留时间显著增加)。据此，高剂量的乙酰左旋肉碱(150 mg·kg-1·d-1)被选作进一步研究的最佳用量。

为了研究乙酰左旋肉碱对顺铂诱导的认知障碍模型小鼠空间学习记忆能力的作用，4组实验鼠进行Morris水迷宫实验。定位航行实验，重复测量数据的方差分析结果显示，不同组间的小鼠潜伏期差异有统计学意义[F(3,34)=6.75，P<0.05]。如图1所示，随着训练天数的增加，各组小鼠找到平台的潜伏期较之前一天均逐渐缩短[F(4,136)=126.01，P<0.05]。然而，与对照组小鼠相比，Cisplatin组小鼠寻找平台的潜伏期显著延长(P<0.05)；而乙酰左旋肉碱(200 mg·kg-1·d-1)治疗可以明显缩短化疗脑小鼠的潜伏期(P<0.05)。结果表明乙酰左旋肉碱能够促进化疗脑小鼠的空间学习能力。

空间探索实验结果显示，4个实验组小鼠在靶象限滞留时间[F(3,56)=31.16，P<0.05]差异无统计学意义。Cisplatin组小鼠在靶象限滞留时间[(16.60±1.61) s VS (27.80±1.01) s，P<0.05]明显少于对照组小鼠；而乙酰左旋肉碱(200 mg·kg-1·d-1)治疗可以显著增加Cisplatin组小鼠在靶象限限滞留时间[(25.07±1.23) s VS (16.60±1.61) s,P<0.05](图2-3)。4个实验组小鼠在速度(图4)上差异无统计学意义，表明乙酰左旋肉碱并不是通过速度或者其他动力因素改善了记忆功能。见图1。

2.2 尼氏染色与对照组小鼠相比，Cisplatin组小鼠海马CA1区胶质细胞增生、排列紊乱、尼氏小体数目明显减少，细胞体积明显缩小、形态不规则、核仁少见，细胞间距增大、轮廓模糊、界限不清。乙酰左旋肉碱治疗后能够显著增加尼氏小体数目。对照组与乙酰左旋肉碱单用组相比，CA1区细胞排列整齐、胞核核仁明显，尼氏小体数目较多、轮廓清晰。结果表明：乙酰左旋肉碱对顺铂诱导的海马神经元损伤具有保护作用。见图5。

①与对照组相比，P<0.05；②与Cisplatin组相比，P<0.05。图1 定位航行实验潜伏期分析

图2 空间探索实验轨迹图

①与对照组相比，P<0.05；②与Cisplatin组相比，P<0.05。图3 空间探索实验平台象限滞留时间分析

图4 空间探索实验总路径

2.3 高尔基染色与对照组小鼠相比，Cisplatin组小鼠CA1区锥体神经元树突棘密度显著减少(P<0.05)；而乙酰左旋肉碱治疗后能够显著增加Cisplatin组小鼠的树突棘密度(P<0.05)。对照组与乙酰左旋肉碱单用组相比，CA1区锥体神经元树突棘密度没有差异。结果表明：乙酰左旋肉碱缓解Cisplatin诱导的小鼠CA1区锥体神经元树突棘的丢失，缓解突触损伤(见图6-7)。

图5 实验组小鼠CA1区锥体神经元尼氏染色情况(尼氏染色，×400)

图6 CA1区锥体神经元树突棘密度(高尔基染色，×100)

①与对照组相比，P<0.05；②与Cisplatin组相比，P<0.05。图7 树突棘密度分析

2.4 线粒体功能顺铂能够损伤线粒体功能，引起ATP合成减少，能量缺乏(表现为与对照组小鼠相比，Cisplatin组小鼠细胞色素c氧化酶活性降低(P<0.01)，ATP合成能力(P<0.05)以及线粒体膜电势均下降(P<0.05)。与Cisplatin组小鼠相比，Cis/Acetyl-L组小鼠脑组织细胞色素c氧化酶活性增加了50.13%(P<0.05)，ATP合成能力增加了33.28%(P<0.05)，线粒体膜电势增加了31.32%(P<0.05)。对照组与乙酰左旋肉碱单用组相比，细胞色素c氧化酶活性，ATP合成能力以及线粒体膜电势均没有差异。结果表明：乙酰左旋肉碱缓解Cisplatin诱导的小鼠脑组织线粒体失功能。见图8-10。

①与对照组相比，P<0.05；②与Cisplatin组相比，P<0.05。图8 细胞色素c氧化酶活性

①与对照组相比，P<0.05；②与Cisplatin组相比，P<0.05。图9 ATP合成能力

①与对照组相比，P<0.05；②与Cisplatin组相比，P<0.05。图10 线粒体膜电势

3 讨论

对CRCI的深入研究表明，化疗诱导的脑线粒体病变在CRCI的发生发展中发挥着重要的作用。顺铂化疗对中枢神经系统产生神经毒性，与CRCI的高发率密切相关。顺铂能够通过血脑屏障，在脑实质和海马区域聚集。顺铂引起的氧化磷酸化效率损伤、ATP供应障碍、氧化应激和钙稳态紊乱作为神经元线粒体功能损伤的重要病理基础，参与CRCI的发生发展。顺铂可以诱导线粒体DNA(mtDNA)损伤，并在培养的大鼠海马神经元和NSCs中损害呼吸活性。顺铂通过促进活性氧的产生，诱导线粒体氧化损伤和凋亡，抑制抗氧化酶和释放自由基。线粒体功能障碍会增加氧化应激，从而刺激自由基的产生，导致树突棘的损失。在动物模型中顺铂引起的认知损伤与神经元树突棘和突触密度的急剧减少呈正相关[15]。顺铂引起的ATP供应障碍、氧化应激和钙稳态紊乱作为神经元线粒体功能损伤的重要病理基础，参与CRCI的发生发展。在培养的海马神经元中，顺铂诱导mtDNA损伤，引起线粒体肿胀或空泡变性，神经元死亡。因此，改善线粒体功能的方法和策略能够缓解化疗诱导脑损伤和认知功能。本研究通过对小鼠海马CA1区神经元树突棘密度的测定，表明乙酰左旋肉碱可以通过缓解线粒体功能损伤而减少树突棘损失，改善突触功能，同时还可促进海马组织内尼氏体的修复，改善顺铂诱导的认知障碍模型小鼠学习记忆功能。

乙酰左旋肉碱(ALCAR)具有线粒体保护功能，能有效防止氧化应激引起的线粒体损伤和随之产生的线粒体依赖性凋亡[13-14]。乙酰左旋肉碱已经被证明可以保护细胞免受线粒体和自由基相关的核DNA损伤，通过减少氧化剂产生和提高抗氧化能力来改善线粒体的功能。乙酰左旋肉碱是一种内源性的代谢中间体，在大脑中存在，参与了乙酰基在代谢和合成代谢过程中的传输，并缓冲了乙酰辅酶A。ALCAR是在许多组织中，包括大脑、肝脏、心脏、肾脏、肌肉等，通过将乙酰基转移到肉碱中合成的，它已经被证明可以保护细胞免受线粒体和自由基相关的核DNA损伤，通过减少氧化剂的产生和提高抗氧化的能力来改善线粒体的功能。

本研究结果显示，乙酰左旋肉碱能够明显改善顺铂诱导的线粒体功能损伤，表现为细胞色素c氧化酶活性降低，ATP合成能力以及线粒体膜电势均下降。线粒体功能障碍会增加氧化应激，从而刺激自由基的产生，导致树突棘的损失。因此，线粒体失功能被认为是引起突触损伤的重要因素，改善者线粒体功能的方法和策略可以有效地保护突触可塑性，延缓认知的神经退行性病变。本研究对小鼠海马CA1区神经元树突棘密度的测定，表明乙酰左旋肉碱可以通过缓解线粒体功能损伤而减少树突棘损失，改善突触功能，同时还可促进海马组织内尼氏体的修复，最终达到改善顺铂诱导的认知障碍模型小鼠学习记忆功能。但乙酰左旋肉碱对顺铂诱导的认知障碍的详细分子机制，还有待进一步探讨。