颅咽管瘤中IL-33/ST2 mRNA表达及其临床意义

汪俊杰，姚 磊，金思怡，司马秀田

颅咽管瘤作为一种罕见的良性肿瘤，好发于鞍内和鞍上区域，由于炎症反应与周围脑组织包绕而难以完全切除，属于鞍区难以治疗的颅内良性病变之一。颅咽管瘤可分为釉质上皮型(adamantine epithelioma，AE)和鳞状乳头瘤型(squamous papillary tumor，SP)[1]。白细胞介素33(interleukin-33，IL-33)是细胞因子白细胞介素1家族中的一员，它与Ⅱ型免疫应答的诱导有关[2]。白细胞介素1受体样1(interleukin 1 receptor like 1，ST2)ST2结构与IL-1β/IL-1R1复合物相似，含有100多个氨基酸[3]。IL-33与ST2结合在机体内发挥效应。IL-33由辅助2型T细胞产生，通过募集下游信号分子MyD88，IL-1R相关激酶和TRAF6并激活MAPKK反作用于AP-1。TRAF6能激活核因子-κB激酶抑制剂复活物，从而产生2型辅助T细胞因子，在炎症反应中发挥重要作用。本研究运用定量PCR技术检测颅咽管瘤患者IL-33和ST2 mRNA的表达，对认识颅咽管肿瘤的发生发展和研究治疗方法有着重要意义。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 临床资料本组研究对象为颅咽管瘤和脑外伤组织标本(对照组)。样本均来自2010年6月至2011年2月在华西医院神经外科接受手术的患者，颅咽管瘤标本经纳入、排除标准筛选出釉质上皮型肿瘤21例、鳞状乳头瘤型15例，共36例，其中男性20例，女性16例，年龄6～62(29.4±21.5)岁。脑组织标本22例来自脑挫裂伤手术患者，其中男性15例，女性7例，年龄22～47(32.6±7.4)岁。纳入标准：①无家族性疾病病史；②既往无手术史；③手术前无放疗、化疗史。排除标准：①合并严重多器官疾病；②合并身体其他部位的肿瘤；③术后病理切片初筛发现肿瘤组织稀少，大片坏死及血凝块等杂质过多者。

1.2 总RNA提取所有实验器械均用0.1%焦炭酸二乙酯(DEPC)水浸泡并高压灭菌(山东博科 型号： BKQ-B75II)。取组织块称重50 mg，加入1 mL Trizol，组织匀浆机(型号：Tissue-Tearor)匀浆，常规Trizol法(美国Rothe公司)提取总RNA。

1.3 反转录反应运用Fermentas公司反转录试剂盒进行反转录反应。冰上预混下列溶液：总RNA 1 μg，随机引物1 μL，DEPC水，瞬时离心，70 ℃预处理5 min，冰上冷却。再依次加入：5×反应缓冲液4 μL，RibolockTM Ribonuclease Inhibitor (20 μg·μL-1) 1 μL，10 mM dNTP mix 2 μL，瞬时离心，37 ℃温育5 min。加入RevertAidTM M-MuLV Reverse Transciptase 1 μL至终反应体积为20 μL。42 ℃温育60 min，70 ℃加热10 min后终止反应，冰浴冷却。置于-20 ℃冰箱保存备用。

1.4 引物设计合成引物由上海英俊公司合成：IL-33上游：5’-ATCCCAACAGAAGGCCAAAG-3’，下游：5’-CCAAAGGCAAAGCACTCCAC-3’；ST2上游：5’-GGATTGAGGCCACTCTGCTC-3’，下游：5’-CCGCCT-GCTCTTTCGTATGT-3’。 β-肌动蛋白(β-actin)作为内参，上游：5’-GGCATCCACGAAACTACCTT-3’，下游：5’-TCCTGCTTGCTGATCCACAT-3’。

1.5 定量PCRPCR反应体系：2×SYBR(Qiagen公司)5 μL，上下游引物各1 μL，cDNA 1 μL，DEPC水补足10 μL。Eppendorf定量PCR仪(型号: Mastercyler ep realplex)上设置反应条件：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40个循环，72 ℃延伸10 min。以β-actin作为内参照，采用2-ΔΔCt进行相对定量。

2 结果

以β-actin基因为内参照，颅咽管瘤组织中IL-33 mRNA表达明显高于对照组，相对定量分别为(0.12±0.13)和(0.06±0.08)(实验组为36例，对照组为22例)，差异有统计学意义(P=0.03)。颅咽管瘤组织中ST2 mRNA表达明显高于对照组，相对定量分别为(0.17±0.18)和(0.04±0.06)，差异有统计学意义(P=0.002)。相关性分析，IL-33和ST2 mRNA表达呈正相关(r=0.35,P=0.04)，见图1。

图1 IL-33和ST2 mRNA表达量相关性分析

IL-33和ST2基因在颅咽管瘤组织两种病理类型(AE和SP)之间进行相对定量分析。结果显示：二者之间差异无统计学意义(P>0.05)。

3 讨论

IL-33作为细胞因子IL-1家族的成员之一，它的作用与Ⅱ型免疫应答密切相关。外源性IL-33的注射可引起身体机能的多种改变，如嗜酸粒细胞增多，消化道和呼吸道上皮增生。这些都与IL-33引起的IgE增多有关。在 信 号 分 子IL-33与ST2结合后，以招募型受体介导的信号转导作用激活AP-1。TRAF6能激活核因子-κB激酶抑制剂复活物，从而产生2型辅助T细胞因子。IL-33在体内有很多重要的作用，如抗感染作用、灭菌作用等，Hazlett等[4]在感染铜绿假单胞菌引起角膜炎的BALB/c和B6小鼠中采用免疫组化的方法检测到IL-33的表达以及其蛋白水平明显增加，且Th-2细胞因子也显著上升 。这些研究显示，IL-33起到了重要作用，它抑制了辅助1型T细胞因子的产生，后通过信号转导升高2型辅助T细胞因子的表达。启动细胞免疫，利用ADCC效应杀灭病原体。IL-33主要对免疫细胞的细胞分化，免疫应答等过程起作用，比如，通过TIIST2L调节免疫细胞。IL-33的刺激对于CD4+T细胞转化为2型辅助T细胞和产生Treg细胞的过程至关重要[1]。

研究发现，IL-33/ST2 mRNA在多组肿瘤组织和细胞中表达较高，有文献已经报道，在非小细胞肺癌中血清的IL-33含量明显高于健康组[5]。但没有颅咽管瘤与IL-33含量之间关系的相关研究。本研究运用定量PCR技术检测颅咽管瘤中IL-33/ST2 mRNA基因的表达量，并探讨IL-33/ST2 mRNA表达与颅咽管瘤临床症状和分型的关系。发现颅咽管瘤中IL-33和ST2 mRNA表达明显增高，并且两者呈正相关。其中r=0.35，表明相关性不强，具体原因有待进一步研究。已有很多文献揭示IL-33在肿瘤转移中的重要作用，例如，结直肠癌中增强的IL-33/ST2 mRNA促进了结直肠癌的转移[6]，卵巢癌中增加的IL-33促进卵巢癌细胞的生长和转移[7]。基于以上研究，IL-33有望在未来成为颅咽管瘤临床诊断、手术预后判断的新的生物学指标。

近年来，关于颅咽管瘤诊断的研究已进入到分子细胞水平，mRNA表达的研究证实其在颅咽管瘤的临床诊断中的重要作用，但还需要更多的研究以证实其在发病机理及术后愈合中的作用。