胰岛素样生长因子通过磷酸化AKT促进颅咽管瘤细胞增殖

姚 磊，汪俊杰，金思怡，司马秀田

颅咽管瘤(craniopharyngioma，CP)现在的主流治疗手段是手术切除[1]，但术后由于激素的缺少，会引起各种并发症，术后需要额外补充激素，比如生长激素[2]。一般来说，生长激素会促进胰岛素样生长因子(Insulin-like growth factor，IGF-I)的局部释放，从而激活IGF-I受体(IGF-I receptor, IGF-IR)。IGF-IR 最初被认为是一种没有实质性作用的受体，然而在最近几年已经作为一种具有独立特征的受体被人们所接受。IGF-IR与细胞的有丝分裂、细胞分化和细胞凋亡有着密切的关系，参与癌症发生和发展[3]。然而，其在颅咽管瘤中的作用尚不明确，本研究从IGF-1出发探讨其在颅咽管瘤细胞增殖中的作用。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 人颅咽管瘤原代细胞体外培养手术中无菌条件下取新鲜、血供好的肿瘤未坏死部分，放入盛有含10%胎牛血清的DMEM/F12中，冰上操作，迅速送至细胞净化培养室培养。

1.2 形态学观察倒置相差显微镜观察：将细胞传代于底部铺有载玻片的培养皿中，培养24 h，使细胞获得良好的贴壁，取出载玻片，Trypan染色计数。

1.3 免疫化学染色鉴定颅咽管瘤细胞采用免疫酶染色法对培养的CP肿瘤细胞行角蛋白(CK7)染色，鉴定组织来源，具体操作步骤按说明书进行。应用的一抗为CK7和IGF-IR。结果判读：随机选5个高倍镜视野，记数300个肿瘤细胞，根据着色细胞的数目判定染色结果。参考Kawamato的标准，棕黄色细胞≤30%为阴性，棕黄色细胞数>31%为阳性。

1.4 人颅咽管瘤细胞生物学检测取指数生长期中的细胞经台盼蓝染色后确定活细胞计数在95%以上，收集细胞，调整密度为1×105·mL-1，接种于6孔培养板中，每孔2 mL，实验组给予终浓度为100 ng·mL-1的IGF-I。对照组只给相应的培养介质。培养1、3、5和7 d后，采用Trypan法对细胞进行计数，并进行MTT检测。

1.5 细胞免疫组化检测p-AKT蛋白表达实验分为IGF-IR阳性组和阴性组，加用IGF-I 100 ng·mL-1干预5～10 min后进行免疫组化染色，方法同1.3，应用一抗为兔抗p-AKT多克隆抗体。

1.6 统计学分析SPSS 13.0处理数据，定量资料采用t检验或者单因素方差分析，定性资料采用χ2检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 CP细胞形态学观察及鉴定

2.1.1 倒置相差显微镜观察肿瘤细胞形态基本一致，早期未贴壁时为圆形透亮，体积较大。贴壁后，两种亚型CP细胞表现有所不同，釉质上皮型肿瘤细胞体积较鳞状乳头型肿瘤细胞体积稍小，似菱形状，排列呈典型的铺路石样，如细胞密度低则表现为类似宽体的梭形细胞；鳞状乳头型肿瘤细胞呈多角(边)型改变，细胞连接较紧密，如细胞密度低，则呈圆形或扇形样伸展。细胞核为圆形或类圆形，体积较大，核∶质约为1∶1，胞质丰富，生长较迅速，见图1。

A：釉质上皮型肿瘤；B：鳞状鳞形乳头型肿瘤(×200)。图1 CP细胞传代培养的典型表现

2.1.2 细胞免疫化学鉴定颅咽管瘤细胞以CK7为抗体对细胞进行免疫学鉴定，抗体为胞质表达呈阳性反应，因此，所培养细胞被认定为上皮细胞细胞来源，见图2。

胞质棕褐色阳性颗粒：A：×200；B：×400。图2 CP细胞CK7阳性染色

2.1.3 细胞免疫化学检测IGF-IR的表达结果显示颅咽管瘤细胞中IGF-IR阳性表达为14例，IGF-IR阴性者15例。病理分类显示，IGF-IR阳性表达的细胞为釉质上皮型11例和鳞状乳头瘤型3例，阳性率为釉质上皮性61.1%和鳞状乳头瘤型37.5%，二者比较差异具有统计学意义(P<0.05)。

2.2 IGF-I对CP细胞增殖的影响

2.2.1 细胞增殖状态及计数体外给予IGF-I 100 ng·mL-1干预培养后，与对照组相比，培养1、3、5和7 d分别进行细胞计数：干预组明显增多，差异有统计学意义(P<0.05)。而且，IGF-IR阳性组的细胞计数也明显多于IGF-IR阴性组的细胞计数，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1、图3。

×105·mL-1

注：①与正常培养组比较，P<0.05；②与IGF-1R(-)比较，P<0.05。

A：IGF-IR阳性细胞，阳性棕色颗粒定位于细胞膜(SP,×400)；B： IGF-IR阴性的肿瘤细胞(SP,×200)。图3 免疫组化显示IGF-IR在CP细胞中的表达

2.2.2 MTT测定结果体外给予IGF-I后，对照组细胞OD值0.122±0.023，实验组中IGF-IR(+)组细胞OD值0.523±0.012，IGF-IR(-)组细胞OD值0.349±0.015，与对照组相比。实验组细胞OD值明显增大，差异具有统计学意义(P<0.05)。IGF-IR(+)组与IGF-IR(-)组比较，差异具有统计学意义(P<0.05)。

2.3 细胞免疫组化检测p-AKT蛋白的表达p-AKT免疫组化阳性细胞为细胞质和/或细胞核呈棕黄色至棕褐色染色。呈核浆型分布，未见单纯胞核着色，染色呈淡黄至棕褐色，以弥漫性分布为主，29例CP细胞在IGF-I干预后p-AKT蛋白阳性表达共25例，表达率为84.50%；未干预组的表达共25例，表达率为41.03%，两组相比差异具有统计学意义(P<0.05)，见图4。

A：在IGF-IR阳性的细胞中p-AKT呈强阳性(+++)，阳性棕色颗粒于细胞膜和细胞质；B：IGF-IR阴性的细胞中p-AKT呈弱阳性(+)反应(SP,×200)。图4 免疫组化显示IGF-I干预后CP细胞中p-AKT的表达

3 讨论

颅咽管瘤是一种较为罕见的脑瘤，治愈后复发率较高[4]。因其瘤体压迫脑垂体和下丘脑，在手术后常常需要长期使用胰岛素样生长因子来进行激素治疗。但由于颅咽管瘤常常伴随着高复发率，同时IGF-I已被证实与多种癌症的发生有关[5-6]，例如乳腺癌和肝癌。IGF-I与颅咽管瘤细胞增殖可能有着密切关系。

作为与胰岛素有同源相似性的生长激素代替物，IGF-I在细胞分化中以及细胞凋亡的过程中不可或缺[7]。已经有研究证明，IGF-I在结直肠癌和乳腺癌等的发生中有着一定的作用：结直肠癌患者血清中的IGF-I水平明显增高，这与IGF-I促进黏附分子的合成有关[8]；IGF-I能刺激正常乳腺上皮细胞生长和肿瘤发生，通过激活磷脂酰肌醇-3激酶途径，以及通过磷酸化AKT通路促进DNA的合成而使癌细胞增殖[9]。目前，关于IGF-1与颅咽管瘤的关系尚缺少相应的文献。本研究运用细胞计数和MTT方法检测IGF-1干预后细胞增殖情况，发现IGF-1可明显促进细胞增殖。

鉴于磷酸化AKT通路在乳腺癌中的作用[9]，IGF-I可能通过磷酸化AKT通路促进颅咽管瘤细胞的增殖。本研究通过免疫组化检测细胞中p-AKT蛋白表达程度，结果显示，IGF-I干预后p-AKT蛋白阳性表达率明显增加，提示IGF-I可能通过增加p-AKT蛋白的表达促进颅咽管瘤细胞增殖，通过干预p-AKT的表达有望成为未来颅咽管瘤治疗新的靶点。

近年来，颅咽管瘤术后康复成为热门研究方向，但对于影响其康复效果及其复发率的因素的探寻还有限，深入探索新的治疗靶点与途径有助于降低颅咽管瘤的复发率。