SIRT1、NF-κB在儿童支气管哮喘中的作用

赵文峰，黄先杰

哮喘为呼吸系统常见慢性疾病，临床表现为气道炎症、气道高反应性和吸入性抗原引起的可变气流阻塞[1]。哮喘可能来自各种致病因子，其分子机制尚未明确[2]。SIRT1(silent information regulator 1,SIRT1)属于sirtuin蛋白质家族，并已被证明可介导多种细胞事件，包括寿命延长、细胞生长和炎症[3]。由于哮喘是一种炎症性疾病，而SIRT1在生理和病理过程中具有抗炎作用，而且也可以修饰很多非组蛋白，包括对NF-κB的去乙酰化作用参与到NF-κB介导的细胞凋亡及炎症反应中[4]。因此，SIRT1对哮喘的发生和进展具有重要意义。本研究重点探讨SIRT1/NF-κB信号通路中SIRT1和NF-κB表达水平，分析其与哮喘发病的关系。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料选择2016年1月至2018年1月在我院接受治疗的41例哮喘患儿为观察组，其中男27例，女14例。年龄3～13(5.84±1.37)岁，均符合儿童支气管哮喘诊断和分级标准[5]，1周内均未接受激素类药物的治疗，排除合并鼻炎、急性呼吸道感染、肺部疾病、异物以及其他慢性疾病者。来我院参加体检的健康儿童为对照组，共40例。无近期感染病史，无个人和家族过敏性疾病史，男25例，女15例，年龄3～13(5.68±1.31)岁。两组患儿的性别、年龄等一般资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2 样本采集及指标检测患儿入院抽取静脉血6 mL，分成3份，每份2 mL。其中一份Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，置入液氮罐中保存备用；另一份3 000 r·min-1离心10 min，留取血清，采用酶联免疫法测定血清IL-6水平，试剂盒购于上海碧云天生物技术有限公司(产品编号PI330)；第三份置EDTA-K2釆血管内，进行Eos计数。

1.3 肺功能指标检测采用德国耶格小儿肺功能仪检测第一秒用力呼气量(forced expiratory volume in 1 second,FEV1)、第一秒用力呼气量/用力肺活量(forced expiratory volume in 1 second /forced vital capacity,FEV1/FVC)、用力呼气中期流量(forced expiratory flow,FEF)25%～75%、FEF50%、FEF75%；同时检测呼出气NO(fractional exhaled nitric oxide,FeNO)，呼出流速控制在50 mL·s-1。每项指标测定3次，计算平均值。测量前详细告知儿童及家长注意事项，测量前行容积校准，4岁以上1～3 L定标筒，3岁以下为100 mL定标筒。配合较差的可口服水合氯醛30～50 mg·kg-1，镇静催眠。

1.4 SIRT1、NF-κB mRNA的表达Trizol法提取PBMC总RNA，按照试剂盒说明逆转录生成 cDNA。采用Agilent M×3000P实时荧光定量PCR仪(Roche Diagnostics，德国)，上海英骏公司合成引物序列。SIRT1(NM_001314049.1)上游序列：5′-ACACAAAATCCAGCAACTCAGC-3′，下游序列：5′-TCCTTTGGATTCCCGCAACC，产物217 bp；NF-κB(Z22949.1)上游序列：5′-GTGTTTCACAC-ACGCACCAG-3′ ，下游序列：5′-ACCCCCTTCCTCC-TATTCAGG-3′T，产物302 bp；β-actin(DQ407611.1)上游序列：5′-CTTCCAGCCTTCCTTCCTGG-3′ ，下游序列：5′-CTTCTGCATCCTGTCGGCAA-3′，产物163 bp。采用相对定量2-△△Ct法比较目的基因水平。

2 结果

2.1 肺功能指标比较观察组的FEV1、FEV1/FVC、FEF 25%～75%、FEF 50%、FEF 75%较对照组显著降低，FeNO较对照组显著增加，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 肺功能指标各组检测结果

注：FEV1：第一秒用力呼气量；FVC：用力肺活量；FEF：用力呼气中期流量；FeNO：呼出气一氧化氮。

2.2 两组IL-6和Eos水平比较观察组的Eos、IL-6水平较对照组均显著增加，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 IL-6和Eos水平各组检测结果

注：Eos :外周血嗜酸性粒细胞;IL-6:白细胞介素-6。

2.3 PBMC中SIRT1、NF-κBmRNA的表达与对照组比较，外周血单核细胞中观察组SIRT1 mRNA水平明显降低，NF-κBmRNA水平明显增加，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表3 SIRT1、NF-κB mRNA的表达

2.4SIRT1、NF-κBmRNA的相关性分析SIRT1 mRNA的表达与FEV1、FEV1/FVC、FEF25%～75%、FEF50%、FE 75%呈正相关(P<0.05)，与FeNO、IL-6和Eos呈负相关(P<0.05)；NF-κBmRNA的表达与FEV1、FEV1/FVC、FEF25%～75%、FEF50%、FEF75%呈负相关(P<0.05)，与FeNO、IL-6和Eos呈正相关(P<0.05)。见表4。

表4 SIRT1、NF-κB mRNA的相关性分析

3 讨论

在本研究中，观察组SIRT1 mRNA水平明显降低，NF-κBmRNA水平明显增加，提示SIRT1能调节机体的炎症反应，并参与调控包括NF-κB等众多炎症相关基因的转录。而且SIRT1能使NF-κB去乙酰化，抑制NF-κB的过度激活，抑制其转录活性，下调基因的表达[6]，这也可能与儿童哮喘的发生和发展有关。

SIRT1也称为NAD-去乙酰化酶，属于sirtuin蛋白家族的一个成员[7-8]。SIRT1已被证明可介导多种细胞事件，包括寿命延长、细胞生长、肿瘤细胞侵袭和炎症[9-10]。由于哮喘是一种炎症性疾病，已有一些学者研究了SIRT1在哮喘的生理和病理过程中的作用[11]。Ichikawa T等发现，在OVA致敏和攻击小鼠中，与盐水致敏和攻击小鼠(对照小鼠)相比，肺中Sirt1mRNA表达明显降低，而细胞浸润，气道嗜酸粒细胞和支气管肺泡灌洗(BAL)白细胞介素IL-4、IL-5和IL-13的水平增加，这表明了抗炎作用[12]。此外，Wang Y等还证实了OVA致敏小鼠肺组织中的SIRT1表达减少[13]。本研究结果显示，哮喘患儿的SIRT1水平较对照组明显下调，并与肺功能指标呈正相关，而与炎症介质及FeNO呈负相关。这些提示SIRT1与哮喘儿童的气道炎症及反应性存在一定的联系，可能参与了哮喘的发生和进展。值得注意的是，SIRT1参与了催化NF-κB的去乙酰化，抑制其炎症功能[14]。NF-κB被鉴定为SIRT1发挥抗炎作用的关键效应物，其可通过调节表达水平发挥对应的功能。而SIRT1可以与NF-κB相互作用，负性调节对应基因的表达，从而调控增殖、凋亡、代谢等[15]。本研究结果显示，哮喘患儿的NF-κB水平较对照组明显升高，并与肺功能指标呈负相关，与炎症介质及FeNO呈正相关。这也说明SIRT1可与NF-κB相互作用，并负性调控下游IL-6的水平，同时也提示SIRT1可通过去乙酰化调控NF-κB表达，抑制炎症水平，延缓哮喘的进展。

总之，下调哮喘患儿SIRT1表达，能抑制NF-κB去乙酰化，并促进IL-6等炎症介质的表达，诱导哮喘的发生和进展。这些也表明，SIRT1激活可能是治疗儿童哮喘的潜在靶点。