不同浓度酒精任氏液对蛙坐骨神经干双相复合动作电位的影响*

黄志华, 魏培坚, 江 玲, 陈 穗, 程必红, 林 颖, 吴林耿, 许秋雄, 吴少伟, 王海燕, 沈建新

(1. 汕头大学医学院临床医学专业本科生， 2. 汕头大学医学院机能学实验室，3. 汕头大学医学院病理生理学教研室， 4. 汕头大学医学院生理学教研室，广东 汕头 515041)

饮料中的酒精成分可给机体各功能系统(特别是神经系统)带来诸多影响。饮用烈性酒或长期酗酒可致情绪不稳、注意力分散、周围性神经病变、酒精中毒性痴呆等神经功能相关变化[1-4]。蛙类坐骨神经干是其外周神经系统中的重要组成部分,其离体标本具有制备方便、长度长、功能稳定的优点,是检测神经干动作电位的理想标本[5-7]。已有一些研究探讨了不同浓度酒精溶液对蛙类坐骨神经干动作电位的影响,但综合分析后发现这些研究或多或少存在各种缺陷(如配液方法错误、给药方法和记录方法不合理等),导致其结论不精确不可靠(详见讨论部分)[5, 8-17]。本研究克服我们发现的这些缺陷,采用自身对照实验设计方法，在离体神经干的中枢端施加刺激,在外周端记录由刺激所引起的双相复合动作电位(biphasic compound action potentials, APs)的波形变化；合理配制的更大范围的不同浓度(1%～80%)酒精任氏液，通过经典神经干屏蔽盒中新加装的加药液槽作用到刺激电极和记录电极之间的一段神经干上，用生物机能实验系统(BL-420F)[6, 17, 18]收集数据，再用自编的程序辅助处理数据，从而系统定量分析不同浓度酒精任氏液对同一神经干AP峰值和传导速度的影响，同时评估其恢复情况。研究结果较全面地揭示了不同浓度酒精任氏液对神经干AP的影响情况，为进一步的深入和精准研究打下良好基础；所采用的实验方法将可推广应用于定量检测药物对外周神经干AP的作用研究中。

1 材料与方法

1.1 实验动物

牛蛙，雌雄不拘，健康，体重约100 g

1.2 主要实验仪器和试剂

常用蛙类手术器械、经典神经干屏蔽盒、生物机能实验系统BL-420F(含硬件,软件和配件，均购自成都泰盟软件有限公司)、无水乙醇、加药液槽等。

1.3 不同酒精任氏液的配制

标准任氏液的配方(g/L): NaCl 6.5、KCl 0.14、Na2CO30.20、NaH2PO40.01、CaCl20.12[5, 6, 17]。先配制5倍浓度的任氏液母液,再按比例各取相应容积的母液、无水酒精和蒸馏水混合成为含不同浓度酒精(0%、1%、2%、4%、8%、16%、32%、48%、64%、80%，容积百分比)的任氏液，保证不同浓度酒精任氏液中各离子浓度与标准任氏液的配方相同。

1.4 蛙坐骨神经干标本的制备和使用

按常规方法制备蛙坐骨神经干标本[5, 6, 17],长度约6～8 cm，在标准任氏液中浸泡30 min后，置于经典神经干屏蔽盒中，形成如图1所示的单通道双相AP记录连接：S1+和S2-是刺激电极的正极和负极，R1是记录电极,R2是参比电极, E是接地线。

1.5 不同浓度酒精任氏液的施加方法

我们在刺激电极S2和地线E之间创新性地加装一个加药液槽，使刺激输出的负极和接地线电极之间的一段神经干浸泡在加药液槽的液体中，通过滴管吸取或添加不同浓度酒精任氏液于加药液槽中，达到既可定量改变局部神经干所接触的液体环境而又不影响电极与神经干接触部位的目的(图1)。

Fig.1Diagram to show how to record biphasic action potentials (APs) from a nerve trunk with a new-armed agent reservoir

S1+ S2-: Stimulating positive and negative electrodes; R1+ R2-: Recording and reference electrodes; E: Ground electrode; Ch1: Channel 1 of the experimental system of BL-420F

1.6 实验记录方案

本实验均在室温(23～25℃)下进行。在标本功能稳定后，加药液槽中首先加的是标准任氏液,记录刺激强度对双相AP的影响情况，作幅度-强度关系曲线，确定标本的最适刺激强度；之后以最适刺激强度以上刺激作为后续实验的固定强度，进行如下系列实验：(1)在标准任氏液作用下,记录双相AP波形；(2)将加药液槽中的标准任氏液置换为某一不同浓度酒精(从1%开始)任氏液，作用5 min后，记录其双相AP波形，此为药物作用后的效应记录；(3)之后用标准任氏液反复冲洗加药槽5次,将加药液槽中的液体完全置换成标准任氏液,浸泡5 min，再次记录双相AP波形，此为冲洗后的恢复记录；(4)如“(3)”能成功记录到AP，则置换加药液槽中的液体为更高浓度的酒精任氏液，重复“(2)”和“(3)”的实验；如“(3)”不能记录到AP，则该标本的实验结束，换下一个标本再从头开始实验记录。采用此流程，一个标本最多可进行20次实验记录，历时约150 min。替换药液时要注意不改变电极与神经干接触的部位，并注意给神经干表面加湿，以保证标本活性和记录的稳定性。

1.7 统计学处理

用BL-420F实验系统记录所得数据均可先导出为文本文件，再通过自编的程序可对其进行自动或半自动的系统定量处理分析和综合比较统计(视需要采用不同的统计分析方法如配对t-检验或随机区组方差分析等)。

2 结果

2.1 坐骨神经干双相AP最适刺激强度的测定和传导速度的计算

在加药液槽中加入标准任氏液，实验系统的刺激参数设置如下：程控单刺激，波宽0.05 ms，延时5 ms，采样率20 000 Hz，刺激强度从0 V开始，逐次增加刺激幅度(增量为0.02 V)；记录所产生的双相AP波形。当实验中观察到双相AP的幅度保持稳定，不再随刺激强度的增大而变化时即可停止本次实验记录。实验结果经处理分析后可发现其表现出如下规律(图2A)： 随着刺激强度的增大，双相AP的波形从无到有，幅度从小到大，增大到一定程度后峰值不再随刺激强度的增大而增大，保持稳定；如把各波形按刺激强度从小到大顺序排列，连接其峰值连线可得到一条长尾S型曲线，该曲线可反映双相AP峰值与刺激强度之间的关系；由此曲线可找出该标本的最适刺激强度(在本例中最适刺激强度为 0.92 V)。通过双相AP的波形，可找出其刺激起点(即刺激伪迹起点)的时间点a和峰值所在的时间点b，由此可得到时间差(t=ab，图2B)； 而刺激电极S2和记录电极R1之间的神经干长度为d(图1),因此，该标本的双相AP平均传导速度v=d/t(在本例中，双相AP平均传导速度为23.53 m/s)(图2B)。

2.2 不同浓度酒精任氏液对神经干AP的影响及其冲洗后的恢复(典型结果示例)

固定刺激强度于最适刺激强度以上刺激(本研究中一般固定为2.0 V，可保证几乎所有标本都达到最适强度以上刺激)，分别记录标准任氏液(Control)和不同浓度酒精任氏液(1%A-80%A)作用于神经干后引起的神经干双相AP波形变化(图3左侧)，并同时记录相应浓度酒精任氏液作用后再用标准任氏液冲洗并浸泡后神经干双相AP波形的恢复情况(图3右侧。 图3为一个典型结果波形示例，图4则是对此典型结果的双相AP峰值和平均传导速度进行标准化处理和比较)。

Fig.2Relationship between biphasic APs of sciatic nerve trunk and stimulus intensity, and the measurement of average conduction velocity

A: Relationship between AP waveforms and stimulus intensity. As stimulus increases, AP starts to appear and its amplitude increases gradually till being stable. A long tail “S” shape curve is formed if connecting the peak points of each AP. The maximal stimulus intensity is determined when the curve begins to reach its plateau (0.92 V in this case). B: A typical AP waveform elicited by a stimulus above the maximal intensity. “a” is the starting time point of a stimulus (i.e. the beginning of the stimulus artifact) and “b” is the time point where AP maximal amplitude is located, and time difference is represented as Δt=ab. So average condition velocity is calculated byv=d/Δt (23.53 m/s in this case; “d” is the nerve distance between S2- and R1+ as shown in Fig.1)

Fig.3Effects of Ringer’s solution with different concentrations of alcohol on action potentials (APs) and recovery after washout (Typical case)

Control: AP under Ringer’s solution without alcohol; 1%A: AP under the treatment of Ringer’s solution with alcohol concentration at 1%; 1%W: AP after washout off “1%A” using Ringer’s solution. Others follow the same naming patterns

Fig.4Effects of Ringer’s solution with different concentrations of alcohol on action potential (AP) peak amplitude and conduction velocity (representative case)

A: Effects of Ringer’s solution with different concentrations of alcohol on AP peak amplitude (effect curve) and recovery after washout (recovery curve); B: Effects on AP conduction velocity (effect curve) and recovery after washout (recovery curve). Original data axis is on the left and standardized data axis on the right; Control: indicates AP under Ringer’s solution without alcohol; 1%A: AP under the treatment of Ringer’s solution with alcohol concentration at 1%; 1%W: AP recovery after washout by Ringer’s solution from being treated with “1%A”, and etc

2.3 不同浓度(1%～80%)酒精任氏液对神经干双相AP峰值和产生概率的影响和恢复情况 (标准化后数据综合分析, n=10)

通过大量实验,我们得到10个标本的完整有效数据。各个标本的峰值数据都以各自标准液时的双相AP的峰值为1进行标准化，并作统计分析可获如下结果(图5)：(1)不同浓度酒精任氏液对神经干双相AP峰值影响的特点：≤4%酒精任氏液对双相AP的峰值无影响；≥8%可使双相AP峰值下降(P<0.05)；≤8%时神经干双相AP的产生概率均为100%(10/10)，但8%时神经干的双相AP峰值已下降到正常时的89%±16%(P<0.05，n=10/10,分母10表示标本总数为10,分子10表示能产生AP的标本数为10,余类推)；16%可使部分(3/10)神经干失去产生AP的能力，此时剩下的7个双相AP的平均峰值下降到59%±28%；32%可使大部分(9/10)神经干失去产生AP的能力，仅剩的1个双相AP的峰值下降到2%；而≥48%可使全部(10/10)神经干失去产生双相AP的能力。(2) 不同浓度酒精任氏液作用后冲洗，神经干双相AP峰值恢复的特点： ≤32%酒精任氏液作用后冲洗，双相AP峰值可完全恢复， 甚至8%和16%作用后冲洗还可使峰值增大(与标准液时相比，P<0.05)；48%作用后冲洗，多数标本(9/10)可恢复产生双相AP的能力，但平均峰值只有正常时的60%±27%；64%酒精任氏液作用后冲洗，还有部分标本(4/10)可恢复产生双相AP的能力，且峰值只有正常时的36%±17%；80%作用后冲洗，无法恢复产生双相AP的能力。

Fig.5Effects of Ringer’s solution with different concentrations of alcohol on action potential (AP) peak and its recovery after washout (summarized analysis,n=10)

A: Curves demonstrating relationship between alcohol concentrations and AP peak; B: Simplified chart showing quantitative effects of alcohol concentration on AP peak, corresponding to the effect curve (Standardized AP peak under “Control” is considered as “1”); C: Simplified chart showing recovery of AP peak after washout, corresponding to the recovery curve

*P<0.05 decreased effectsvscontrol;#P<0.05 increased recoveryvscontrol;△P<0.05 decreased recoveryvscontrol

2.4 不同浓度(1%～80%)酒精任氏液对神经干双相AP传导速度的影响和恢复情况(标准化后数据综合分析, n=10)

对上述10个标本的神经干双相AP的平均传导速度数据都以各自标准液时的平均传导速度为1进行标准化，并作统计分析，可获得如下结果(图6)：(1) 不同浓度酒精任氏液对双相AP传导速度的影响：≤4%酒精任氏液作用后传导速度虽有下降趋势，但均未达到显著差异水平(P>0.05)；≥8%酒精任氏液作用后传导速度则显著下降(P<0.01)，8%酒精任氏液作用后传导速度为正常时的87%±11%(n=10/10),16%酒精任氏液作用后传导速度为正常时的75%±11%(n=7/10),32%酒精任氏液作用后传导速度为正常时的74%(n=1/10)；(2)不同浓度酒精任氏液作用后冲洗，双相AP传导速度的恢复情况： ≤8%酒精任氏液作用后冲洗, 双相AP的平均传导速度与正常无异(n=10/10)，完全恢复；≥16%作用后冲洗,则双相AP的平均传导速度无法完全恢复，平均传导速度明显比标准液时低(P<0.05,n=10/10)：16%时，平均传导速度为标准液时的88%±16%(n=10/10)；32%时，平均传导速度为标准液时的82%±16%(n=10/10)；48%时，平均传导速度为标准液时的78%±20%(n=9/10)。

Fig.6Effects of Ringer’s solution with differentconcentrations of alcohol on action potential (AP) conduction velocity and its recovery after washout (summarized analysis,n=10)

A: Curves demonstrating relationship between alcohol concentrations and averaged conduction velocity; B: Simplified chart showing quantitative effects of alcohol concentration on AP conduction velocity, corresponding to the effect curve (Standardized conduction velocity under “control” is considered as “1”); C: Simplified chart showing recovery AP conduction velocity after washout, corresponding to the recovery curve

**P<0.01 decreased effectsvscontrol;#P<0.05 decreased recoveryvscontrol

3 讨论

3.1 与已有研究相比,本研究的特色

神经干AP是反映外周神经功能的重要指标。已有一些研究探讨不同浓度酒精溶液对蛙类坐骨神经干AP的影响。但综合分析后发现这些研究或多或少存在各种缺陷，主要的缺陷主要是以下两种：(1)实验中所用不同浓度酒精溶液的配制方法不明确[8-10]，或配制方法不合理[11-13]：基本都用标准任氏液(有的可能直接用蒸馏水)将95%的酒精或无水乙醇按容积比配制成1%～12%或其他百分比的酒精溶液，这会导致终溶液中标准任氏液的成分与正常时相比发生较大改变，而不只是酒精浓度的不同，特别是在高浓度的时候。(2)更换不同浓度药液时，采用浸泡法[5, 10-20]，即将神经干从标本盒上取下，浸泡到相应的药液中一段时间，之后再放到标本盒中继续实验；这会导致神经干的刺激部位和记录部位发生改变，从而受刺激产生AP的纤维数量发生变化，能被记录到的纤维数量也发生变化，而这些变化是人为的而不是由于药液的改变所产生的，因此会严重影响同一标本的不同次实验记录结果之间的可比性。由于上述种种缺陷的存在，导致影响相关研究的数据及结论的可靠性和精确度。

本工作通过分析文献中已有研究的不足，并在实际测试中反复探索实践，最终采用一套能克服上述缺陷的优化研究方法(此方法在现有研究的文献中未发现)：(1)采用更合理的方法配制不同浓度的酒精任氏液(详见材料与方法部分)，基本原则是以不同浓度的酒精溶液为底液配制标准任氏液；而不是反过来：以标准任氏液为底液配制不同浓度酒精的任氏液；从而保证在终溶液中任氏液的各基本成分在溶剂中的摩尔浓度与标准任氏液中的完全一样，因而标本不会因为无机盐成分的浓度改变而影响活性；这样可确保标本功能的改变都是因为酒精浓度的改变而引起的。这也是为什么本研究配液时要使用5倍浓度的任氏液母液而不用标准任氏液的原因。 (2)采用在经典标本盒的刺激电极和记录电极之间加装加药液槽的方法(图1)，从而达到方便更换药液，同时不改变刺激部位、不改变记录部位、也不改变药物作用部位的目的，这样可保证除了药液成分的不同外，其他条件都完全一致，确保同一标本在不同药液的作用下其结果具有严格的可比性。

此外，本研究提供了实验数据的原始波形和数据的处理分析及标准化的详细流程和方法(图3，4)：只有在正常情况下能得到典型双相AP波形的标本，才能进行后续的实验流程；只有严格按要求走完所有实验流程(同一标本最多可进行19次不同药液的作用和记录)的结果，才是一套完整有效的实验结果。

还有，本研究不仅严格采用自身对照实验设计方法，覆盖更宽酒精浓度范围(从1%到80%)，更有意义的是: 本研究还系统地记录了不同浓度酒精任氏液作用后冲洗，神经干双相AP的恢复情况，从而使得本研究的结果更全面、更系统且更有实用意义(如可以作为高浓度酒精损伤后是否可恢复的重要参考)，从而保证本研究的相关结论具有更好的可靠性和实用性。

3.2 不同浓度酒精任氏液对神经干双相AP的影响特点

本研究采用系统定量的方法比较分析所得到的10例完整的有效数据(图5，6)，发现：与标准任氏液的情况相比，(1)低浓度(≤4%)酒精任氏液对神经干的双相AP的峰值无影响；浓度≥8%酒精任氏液可使神经干的双相AP峰值显著下降(P< 0.05)，虽然8%酒精任氏液时神经干双相AP的产生概率仍为100%(10/10)(图5)。峰值的降低主要是因为兴奋的神经纤维数量减少，而不可能是因为某些单根神经纤维的AP峰值降低所致,原因是在我们的实验方法中,记录电极所处位置的神经干是不受酒精影响的,是完好的。(2)16%酒精任氏液可使部分(3/10)神经干失去产生AP的能力，此时仅剩的7个双相AP的峰值下降到59%±28%(标准化后的峰值)；32%酒精任氏液可使大部分(9/10)神经干失去产生AP的能力，仅剩的1个双相AP的峰值下降到2%；而≥48%可使全部(10/10)神经干失去产生双相AP的能力(图5)。可见神经干受刺激后产生AP的概率随着酒精浓度的升高而降低,呈现一定的剂量效应；神经干失去产生双相AP能力的原因可能是一定浓度的酒精成分可使产生AP的相关通道蛋白(如钠离子通道或钾离子通道蛋白或钠钾泵蛋白)发生可逆或不可逆的功能变化。 (3)低浓度酒精任氏液对AP传导速度无显著影响，而≥8%酒精任氏液作用后传导速度明显下降(P<0.01, 图6)。酒精成分影响AP传导速度的原因可能在于：传导速度快的神经纤维对酒精更敏感，因而更容易失去产生AP的能力；或者酒精分子可能影响AP相关蛋白的动力学效应或离子进出通道的速度。综合上述结果，可知，低浓度酒精(≤4%)任氏液作用后对双相AP峰值和传导速度无显著影响；到8%时，AP的峰值和传导速度已发生显著减小或减慢。16%的酒精可使部分神经干完全失去产生双相AP能力；32%可使大部分神经干失去产生双相AP的能力，48%则可使所有神经干都失去产生双相AP能力。因此，通过进一步的精细化实验，应该可进一步明确使神经干AP开始出现下降、明显下降和完全丧失的酒精浓度临界值的范围。这些浓度范围的明确，对于评估不同酒精浓度对人体的危害有一定的参考意义。

3.3 不同浓度酒精任氏液作用后冲洗神经干双相AP的恢复特点

在探究不同浓度酒精任氏液对神经干双相AP的影响效应的同时,本研究还系统定量比较分析了不同浓度酒精任氏液作用后再用标准任氏液冲洗,神经干双相AP在峰值和产生概率及传导速度等方面的恢复情况,发现：(1)≤32%酒精任氏液作用后冲洗，神经干双相AP的峰值可完全恢复到标准任氏液时的水平，甚至8%和16%酒精任氏液作用后冲洗还可使AP峰值增大(与标准液时相比，P< 0.05)，相关机制有待进一步明确；(2)48%酒精任氏液作用后冲洗，多数标本(9/10)可恢复产生双相AP的能力，但平均峰值下降至60%±27%；64%酒精任氏液作用后冲洗，仍有部分标本(4/10)可恢复产生双相AP的能力，但峰值下降至36%±17%；80%酒精任氏液作用后冲洗，神经干无法恢复产生双相AP的能力,此时估计所有神经纤维膜上的蛋白质已经发生不可逆的变性,因而功能无法恢复。(3)≤8%酒精任氏液作用后冲洗, 双相AP的平均传导速度与正常无异；≥16%而≤64%的酒精任氏液作用后冲洗,双相AP的平均传导速度无法完全恢复：与标准液时相比，平均传导速度显著降低(P<0.05)。上述结果表明,一定浓度的酒精(如≤8%)作用于神经干后,如及时去除酒精的影响,神经干产生双相AP的功能(包括峰值和传导速度)是可以完全恢复的；但超过一定浓度(如≥16%)后，即使AP的幅度可以完全恢复，但传导速度却无法完全恢复，这说明此时神经干中的有些神经纤维的功能状态已经发生不可逆的改变；浓度更高(如80%)时，神经干功能完全失去恢复的可能。通过进一步的精细化实验，应该可以进一步明确酒精作用后功能可以完全恢复以及完全无法恢复的酒精浓度范围，这对于判断酒精损伤后的预后有重要参考意义。

综上所述, 本研究克服了同类研究中存在的配液不合理、给药不科学、结果可靠性不足等种种缺陷[5, 8-20]，严格采用自身对照实验设计和系统定量数据分析方法，在更广的浓度范围(1%～80%)内，探究了不同浓度酒精任氏液对蛙坐骨神经干双相AP的峰值和传导速度的作用及冲洗后神经干功能恢复的情况，获得了一系列定量较精准的规律性变化，并提出可以进一步精细定量研究的方向。其他动物特别是哺乳类动物如大、小鼠或兔子的神经干是否也有类似的情况也是值得定量探究的内容。本研究结果使我们对酒精的外周神经作用的认识更全面更精准，对日常酒精饮料的合理使用有一定的参考意义，也有助于判断酒精使用过量所致损伤的预后恢复效果。