AR表达与乳腺癌21基因复发风险评分的关系研究

胡建军 杨文君 孙习英 张著学 易韦

(贵州省人民医院病理科，贵州 贵阳 550002)

乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一，近年来其治疗采用以手术为主，化疗、放疗、内分泌治疗、靶向治疗为辅的综合治疗策略，这一治疗模式极大地降低了乳腺癌的复发转移风险及死亡率。随着乳腺癌分子病理研究的快速进展，逐步发现除了常规的临床病理指标外，一些与乳腺癌发生及进展相关的基因检测更能准确预测肿瘤的复发转移风险，从而判断患者是否能从化疗中获益，避免过度治疗。21基因复发风险评分(recurrence score，RS)是S.Paik等[1]于2004年首次提出，通过检测乳腺癌石蜡包埋标本中16个肿瘤相关基因(包括肿瘤增殖相关基因Ki67、STK15、survivin、cyclinB1、MYBL2，侵袭相关基因stromelysin 3、cathepsin L2，HER-2相关基因GRB7、HER-2，激素相关基因ER、PR、Bcl-2、SCUBE2以及其他三个基因GSTM1，BAG1，CD68)及5个参考基因的表达情况进行复发风险评分，用于评估ER阳性、HER2阴性、腋窝淋巴结阴性早期乳腺癌患者的复发风险。临床研究[2]NSABP B-14和NSABP B-20已经证实21基因RS值可以预测乳腺癌患者能否从化疗中获益，并提出将RS值分为三个等级：RS<18时为低复发风险，18≤RS<31时为中复发风险，RS≥31时为高复发风险。大规模的临床研究[3]证实，RS可预测不同组别患者从他莫西芬和辅助化疗中的获益，从而指导临床根据患者的RS值及临床病理因素决定患者的治疗方案。RS评分采用加权评分系统，其中增殖相关基因被赋予最高权重+1.04，而激素相关基因被赋予最低权重-0.34。癌细胞的增殖指数是乳腺癌的高危因素，用免疫组织化学的方法检测Ki67的表达判断肿瘤细胞的增殖指数是病理诊断中最常用的方法。临床研究[4-5]及meta分析均发现Ki67超表达的乳腺癌患者转移复发时间和总体生存时间均较短，是乳腺癌的不利因素。激素受体ER及PR高表达是乳腺癌内分泌治疗获益的预示因素，并且与乳腺癌预后良好相关[6]，也是选择内分泌治疗方案的依据[7]。雄激素受体(AR)与乳腺癌的关系近年来也倍受重视。基于AR表达与乳腺癌预后的meta分析显示，在不考虑ER表达的条件下AR高表达提示乳腺癌患者复发风险较低和预后良好[8]。本研究通过分析ER阳性、HER2阴性、腋窝淋巴结阴性的早期乳腺癌患者的21基因RS值及AR表达情况，探讨21基因RS值与AR表达之间的关系，为早期乳腺癌的治疗策略制定提供参考。

1 材料与方法

1.1研究对象 选择2017年1月至2018年10月收治于贵州省人民医院乳腺外科和肿瘤科行21基因检测的早期乳腺癌患者共56例，均为女性，年龄34～72岁，中位年龄47岁。所有纳入研究的病例诊断均为乳腺浸润性癌，ER阳性、HER2阴性、腋窝淋巴结阴性，肿瘤直径均<4 cm。

1.2临床病理资料的收集 所有研究对象均选择于本院行手术切除治疗的档案组织标本。回顾性收集所有选择的研究对象的临床病理诊断资料，包括肿瘤大小、组织学分级，及ER、PR、HER-2、Ki67、p53等指标的免疫组化及HER-2基因扩增的FISH检测结果。所有病理诊断均为初级医师阅片、中级医师诊断、高级病理医师复诊的诊断结果。

1.3AR的免疫组化染色及判读 选择所有研究病例的病理档案标本蜡块，2～4 μm切片，捞片时每例标本同时贴上已知AR阳性及阴性的组织切片作为对照，60℃烤片1～2 h。所用AR抗体为兔抗人雄激素受体单克隆抗体(稀释浓度为1∶100，克隆号EP120，购自北京中杉金桥生物技术有限公司)。免疫组化染色采用Leica Bond-Max全自动免疫组化染色系统(Leica Biosystems，Bannockburn，IL，USA)进行。AR染色评分采用Allred创建的激素受体评分系统，任何区别于背景着色的细胞核染色均判读为阳性。

1.4乳腺癌21基因检测方法及评分 乳腺癌21基因检测采用文献[1]报道的荧光定量PCR(qRT-PCR)法。所有标本的荧光定量PCR检测及RS评分均由苏州科诺医学检验所完成。RS值分为三个等级：RS<18时为低复发风险，18≤RS<31时为中复发风险，RS≥31时为高复发风险。根据文献[9]报道的方法，RS评分将研究对象分为2组：RS<18即低复发风险组25例(44.6%)，RS≥18即中高复发风险组31例(55.4%，其中包括中复发风险18例，高复发风险7例)。

1.5病理参数变量 病理参数变量的赋值见表1所示。

表1 乳腺癌复发风险RS值与临床病理参数赋值

1.6统计学方法 应用SPSS 19.0软件进行统计学分析，计数资料比较采用χ2检验和连续校正χ2检验；等级资料采用非参数检验，非参数检验采用独立样本Wilcoxon秩和检验；相关性分析采用Spearman相关性分析；以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1AR在乳腺浸润性癌中的表达 AR在大多数的乳腺浸润性癌中呈高表达的模式，在极少数病例中呈低表达(1%左右阳性)，在少数病例中表达阴性，且AR主要定位于癌细胞的细胞核中(见图1)。纳入研究的56例标本中，AR强阳有47例(83.9%)，AR局灶阳性2例(3.6%)，AR阴性7例(12.5%)。

注：A.乳腺浸润性癌的HE染色；B.乳腺浸润性癌AR免疫组化染色(EnVision 法)

图1乳腺浸润性癌中AR的表达

2.221基因分值与临床病理特征参数的关系 在纳入研究的56例ER阳性、HER2阴性、腋窝淋巴结阴性病例中，低复发风险组(RS<18)共计25例(44.6%)，中高复发风险组(RS≥18)共计31例(55.4%)。两个分组中比较了患者年龄、肿瘤直径、组织学分级、AR、PR、Ki-67、p53几个病理学参数RS值的差异，其中肿瘤直径(P=0.010)、AR表达(P=0.033)、PR表达(P=0.010)三个参数对RS值的影响差异有统计学意义，其他病理学参数患者年龄、组织学分级、Ki-67、p53分组的RS值之间没有显著性差异。见表2。

表2 21基因RS值与临床病理参数的相关性

注：a为连续校正χ2检验。

2.321基因RS值与AR、PR、Ki-67表达的相关性分析 根据21基因RS值的评分，将56例乳腺癌研究对象根据AR、PR、Ki-67的表达情况分组，分别对每一分组与21基因RS值的评分进行Spearman相关性分析。结果显示，AR表达与21基因RS值的评分呈负相关(r=-0.327，P=0.0028)，PR表达也与21基因RS值的评分呈负相关(r=-0.446，P=0.0034)，而Ki-67的表达与21基因RS值的评分没有明显的相关性。见表3。

表3 21基因RS值与AR、PR、Ki-67表达的相关性

3 讨 论

乳腺癌的早期诊断和治疗近十多年来取得了很大的进展，使得该病的复发转移率和死亡率明显下降。但是，早期乳腺癌术后辅助治疗方案的选择仍存在较大的争议。特别是对于激素受体阳性HER-2阴性且没有腋窝淋巴结转移的患者，是否需要化疗主要依赖于肿瘤的病理诊断报告中的病理学参数，如肿瘤大小、组织学分级、患者的年龄及免疫组化标记的结果。然而依据这些参数往往会对患者进行错误或不当的评估，尤其是对于化疗获益较少的患者，不当的评估会导致过度治疗。因此，亟需建立新的评价系统和指标对该部分患者进行全面评估。

乳腺癌21基因是基于荧光PCR技术的乳腺癌多基因检测，用于评估ER阳性、HER2阴性、腋窝淋巴结阴性的乳腺癌患者从化疗中获益的情况。临床研究[10-11]NSABP B-14和NSABP B-20发现，RS值与患者的10年复发率相关，是优于其他指标如患者年龄、肿瘤大小的独立预后因素；并且化疗获益与RS值显著相关，当RS>31时即高复发风险患者组化疗获益较大，RS<18组化疗获益较小。对NSABP B-14和NSABP B-20的数据进行生存分析，发现10年局部复发率和RS值密切相关[2]。因此，2018年的NCCN乳腺癌指导意见修改为对激素受体阳性，HER2阴性，腋窝淋巴结阴性或≤2 mm淋巴结微转移灶、直径>0.5 cm的浸润性乳腺癌建议行21基因检测[12]。AR在预测乳腺癌的预后及治疗靶点的选择方面近年来被广泛关注。Meta分析[8]结果提示AR表达阳性与未发生转移的乳腺癌患者生存期延长相关。但是，在21基因RS值评分过程中，并未考虑到AR的表达情况。

本研究对ER阳性、HER-2阴性、腋窝淋巴结阴性并行21基因检测的乳腺癌患者的病理档案标本检测了AR的表达情况，并进行了回顾性研究，研究结果发现，AR在ER阳性的大多数乳腺浸润性癌中表达，进一步对RS值与临床病理特征参数的关系分析发现，低复发风险组(RS<18)和中高复发风险组(RS≥18)两个分组中，肿瘤直径、AR表达、PR表达三个参数对RS值的影响差异有统计学意义，其他病理学参数患者年龄、组织学分级、Ki-67、p53分组的RS值之间没有显著性差异；进一步对RS值与AR、PR、Ki-67表达的相关性进行分析，发现RS值与AR表达及PR表达呈负相关，而与Ki-67的表达没有明显的相关性。总之，AR可以影响21基因RS值，与其是负相关的关系，这表明AR高水平表达意味着RS值较低，患者的复发风险较低；相反，AR低表达意味着RS值可能较高，患者的复发风险也较高，但从化疗中获益的可能性较大。AR与21基因RS值之间具有相关性的具体机制目前还不能合理解释，AR与影响21基因评分的其他基因的表达特性之间是否存在相关性还需要进一步进行临床及基础方面的研究。F.E.Vera-Badillo等[13]的研究发现，AR的表达与ER和PR表达呈正相关。但AR影响RS值是否与ER和PR有关系也还有待进一步研究。以往的研究[14]发现Ki-67表达是影响21基因RS值的一个重要因素，Ki-67高表达(Ki-67≥25%)组中RS值为中高复发风险，Ki-67低表达(Ki-67<10%)组中RS值为中低复发风险。但本研究的结果发现，不同分值的RS值分组中Ki-67的表达没有显著差异，并且Ki-67与RS之间无显著相关性，导致这一差异的原因可能是选择的研究对象的样本量的差异，本研究的样本量较小；另外，本研究选择的仅是行21基因检测的ER阳性、HER-2阴性、腋窝淋巴结阴性的病例，可能不能完全代表ER阳性、HER-2阴性、腋窝淋巴结阴性这一组病例的Ki-67表达与RS值的特性。

21基因检测结果与治疗方案的选择目前仍存在较大的争议，特别是对于RS值在中风险的患者更难决定。最新的基于TAILORx临床研究[3]提示，年龄>50岁，HR+/HER2-/腋窝淋巴结阴性、复发风险评分0～25的女性患者以及年龄≤50岁，HR+/HER2-/腋窝淋巴结阴性、复发风险评分0～15的女性患者可免除化疗，该研究提示，对于绝经后的患者，RS评分位于18～25之间可安全免除化疗的痛苦，但RS位于26～31之间的患者是否需要联用化疗，还是亟待解决的问题，期待后续研究解答。

综上所述，ER阳性、HER-2阴性、腋窝淋巴结阴性的早期乳腺癌患者的AR表达与21基因RS值呈负相关，可能是影响21基因RS值的一个重要因素。AR是否对早期乳腺癌的治疗方案的选择有意义还需进一步深入研究。