环状RNA在系统性红斑狼疮疾病中的筛选及表达

朱勤爱，温旺荣

(暨南大学 附属第一医院 临床医学检验中心， 广东 广州 510630)

系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus, SLE)是一种严重的慢性自身免疫性疾病，多发于20～40岁育龄女性，常累及多脏器，造成结缔组织炎症，严重者可出现肾功能衰竭等[1].全球SLE的发病率平均在20～150/10万人，我国的发病率在100/10万人左右[2].SLE的发病机制尚未完全清楚，与遗传因素、环境因素、内分泌状态，尤其是雌激素水平等相关[2-3].

研究表明环状RNA(circular RNA，circRNA)与多种人类疾病、生理结构和功能有密切的关系.circRNA形成调控机制模型主要有3种：①剪切体介导的circRNA形成.circRNA也是RNA拼接的产物，形成过程同样受到剪切体的调控和影响[4].②反向互补序列介导的circRNA形成.③RNA结合蛋白介导的circRNA形成机制.还存在circRNA形成的调控机制模型，通过RNA结合蛋白介导[5].

关于环状RNA的功能，也有代表性的功能模型.环状RNA的功能包括：①作为内源性竞争RNA(competing endogenous RNA,ceRNA)竞争性结合miRNA的miRNA海绵模型(miRNA Sponge)；②内含子自身环化形成的circRNA(circular intronic RNA,ciRNA)、外显子-内含子来源的circRNA(exon-intron circular RNAs,EIciRNA)促进基因转录作用的模型；③与蛋白相互作用调控其他分子的相互作用模型(protein sponge)；④通过影响RNA拼接作用的终产物，从而导致RNA终产物因缺少起始密码子而不能正常翻译，作为“mRNA Trap”的模型；⑤环状RNA通过内部核糖体插入位点序列(internal ribosome entry site,IRES)元件或N6-甲基腺苷 (N6-methyladenosine,m6A)修饰直接翻译多肽或蛋白.

目前环状RNA的研究多采用表达谱基因芯片技术来筛选差异表达的目标环状RNA.基因芯片检测可获得巨大的数据量，但受不同筛选样本量、样本来源的影响，筛选出来的环状RNA差异表达谱存在巨大差异，说明基因芯片技术存在一定的局限性，同时也说明了SLE疾病发病机制的复杂性.本研究采用CIRCpedia数据库信息，通过前期大量的数据分析整理出SLE疾病相关基因所对应的circRNA，在所有血液和免疫系统来源的记录中，挑选出校正表达值(mapped back-splicing junction reads permillion mapped reads，RPM)排序靠前的circRNA，设计引物进行实时荧光定量PCR(quantitative peal-time PCR，RT-qPCR)分析表达差异；针对目标环状RNA及对应的基因进行表达验证；针对目标环状RNA预测可能与其结合的miRNA，分析其在SLE疾病中可能发挥的作用.

1 材料与方法

1.1 研究对象

SLE病例来自2016年8月至2017年2月在暨南大学附属第一医院风湿科诊断的患者.按1997年修订的美国风湿病学会SLE诊断标准诊断，对照组(NC组)来自健康体检者.本研究经暨南大学附属第一医院医学伦理学委员会批准，参与者均知情同意.

第一阶段收集SLE病例和正常体检对照组各10例，9女1男，用于环状RNA的筛选，实验组年龄13～46岁，平均年龄(30.1±10.3)岁；对照组年龄22～50岁，平均年龄(31.1±8.9)岁.

第二阶段收集SLE病例和对照组各30例，28女2男，用于独立验证，实验组年龄14～67岁，平均年龄(29.3±14.1)岁；对照组年龄17～55岁，平均年龄(31.5±8.0)岁.

1.2 主要试剂和仪器

TRIzol试剂盒购自美国Invitrogen公司；NormalRun TM 250bp-II DNA ladder购自上海捷瑞生物工程有限公司；Geneseed® II First Strand cDNA Synthesis Kit,Geneseed® qPCR SYBR® Green Master Mix,HSA_CIRCpedia_17062、HSA_CIRCpedia_17068、HSA_CIRCpedia_7639、HSA_CIRCpedia_58217、HSA_CIRCpedia_51921、HSA_CIRCpedia_7637、HSA_CIRCpedia_61386、HSA_CIRCpedia_27400、HSA_CIRCpedia_27403、SLC15A4以及内参照ACTB引物购自广州吉赛生物公司产品；稳压稳流电泳仪为北京君意公司产品；全自动凝胶成像分析系统为上海培清公司产品；K2800核酸分析仪为北京凯奥；PRISM®7500定量PCR仪为美国ABI公司产品.

1.3 RNA提取与逆转录

采集各研究对象清晨空腹静脉血3.0～5.0 mL于EDTA抗凝管，收集后3 h内送入实验室，1 500 r/min离心5 min后收集血浆，分装于1.5 mL无RNA酶的EP管，置-80 ℃冰箱冻存备用.使用Trizol试剂提取总RNA，质量分数为1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA样品是否存在降解及杂质，并通过分光光度计检测提取的RNA的质量.

1.3.1 筛选实验的引物设计

根据GeneCards数据库中HSA_CIRCpedia_17062、HSA_CIRCpedia_17068、HSA_CIRCpedia_7639、HSA_CIRCpedia_58217、HSA_CIRCpedia_51921、HSA_CIRCpedia_7637、HSA_CIRCpedia_61386、HSA_CIRCpedia_27400、HSA_CIRCpedia_27403序列，采用Primer premier 5.0软件设计引物，以ACTB基因为内参照，引物序列(表1).

表1 筛选实验逆转录及RT-qPCRF引物序列1)Table 1 Screening for experimental reverse transcription and RT-qPCR primer sequences

1)针对HSA_CIRCpedia_58217、HSA_CIRCpedia_51921、HSA_CIRCpedia_27400、HSA_CIRCpedia_27403分别设计了2对引物进行复测.

1.3.2 验证实验引物设计

根据GeneCards数据库中SLC15A4基因序列，采用Primer premier 5.0软件设计引物，以ACTB基因为内参照，引物序列(表2).

表2 验证实验逆转录及RT-qPCR引物序列Table 2 Validation of experimental reverse transcription and RT-qPCR primer sequences

1.3.3 RT-qPCR反应条件

95 ℃ 5 min预变性； 95 ℃ 10 s变性， 60 ℃ 34 s退火延伸，读板，循环40次.绘制熔解曲线，95 ℃ 15 s，然后从60 ℃向95 ℃每升温0.5 ℃，时间间隔5 s，记录1次荧光值，运用PRISM®7500 Sequence Detection System进行熔解曲线分析.结果以Ct值显示，Ct值为每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数，采用相对定量法来比较上述环状RNA的表达差异.

1.3.4 统计方法

定量PCR所得的最终分析结果在实验组和对照组中进行Student T test分析，使用Excel软件，设置为双尾成对检验，P<0.05有统计学差异.

1.4 MiRNA Sponge分析

使用3种方法(TargetScan, Miranda, RNAhybrid) 预测环状RNA的靶向miRNA，取3种方法交集获得最终的miRNA列表.基于TargetScan 方法的输出文件对每一环状RNA的结合位点数目进行排序所得的环状RNA列表，数目越多越可靠.基于Miranda方法的输出文件对每一环状RNA的总预测分数进行排序所得的环状RNA列表，分数越高越可靠.基于RNAhybrid方法的输出文件对每一环状RNA的P值进行排序所得的环状RNA列表，P值越低越可靠.

2 结果

2.1 SLE疾病相关基因对应环状RNA的筛选

经过系统的文献汇总分析，共整理6个主要类型的SLE疾病相关基因,利用CIRCpedia数据库检索这些基因所对应的环状RNA的信息，以RPM≥0.05作为筛选条件，接着详细摘录了所有符合筛选条件的数据库记录，优先选择血液和免疫系统来源，筛选出9个候选环状RNA(表3).

表3 9个候选环状RNA信息Table 3 9 candidates′ circular RNA information

2.2 所筛选的环状RNA的验证

2.2.1 所筛选环状RNA的定量PCR检测结果

定量PCR分析结果显示，HSA_CIRCpedia_7637在SLE患者组中明显降低,有统计学差异(P=0.048 1，图1A)；而HSA_CIRCpedia_17062(P=0.785 9)、HSA_CIRCpedia_17068(P=0.642 5)、HSA_CIRCpedia_61386(P=0.286 8)、HSA_CIRCpedia_7639(P=0.113 2)有差别,但无统计学差异(图1B).

1) 与对照组比较,P<0.05.

1) 与对照组比较,P<0.05.

还有4种候选环状RNA：HSA_CIRCpedia_58217、HSA_CIRCpedia_51921、HSA_CIRCpedia_27403、HSA_CIRCpedia_27400，在筛选实验中未检测出信号.针对4种环状RNA均设计了2对引物进行复测，结果仍为阴性.排除实验操作和设计的原因，最可能导致阴性的因素是标本中不存在对应模板或标本来源不同.

2.2.2 HSA_CIRCpedia_7637和SLC15A4在SLE病人中表达验证

再收取更多数量的SLE患者和健康对照组，各30例，分别用荧光定量PCR进行表达量检测.结果表明SLE患者的HSA_CIRCpedia_7637和SLC15A4表达量均明显低于对照组.HSA_CIRCpedia_7637表达量在SLE患者和对照组间差异非常显著，P=0.000 3；SLC15A4表达量在SLE患者和对照组间差异也非常显著，P=0.006 9(图2)；且两者表达差异显著,均有统计学差异.

2.3 与HSA_CIRCpedia_7637竞争性结合的micro-RNAs的预测

分别用TargetScan、Miranda和RNAhybrid 3种工具对HSA_CIRCpedia_7637可能结合的miRNA进行预测分析.TargetScan预测到86种潜在的miRNA，Miranda预测到72种，RNAhybrid预测到138种(图3).

图2 SLE患者HSA_CIRCpedia_7637和SLC15A4表达分析

图3 3种工具预测HSA_CIRCpedia_7637可能结合的miRNA

经过比较分析，3种工具共有11种miRNA是一致的， miRNA分别为：hsa-miR-6754-5p、hsa-miR-6165、hsa-miR-4270、hsa-miR-6894-5p、hsa-miR-638、hsa-miR-6090、hsa-miR-4739、hsa-miR-4722-5p、hsa-miR-4459、hsa-miR-2392、hsa-miR-1255b-5p.

3 讨论

一般的RNA分子都存在游离的5′和3′端，环状RNA则不同，其5′和3′端共价结合在一起而成环状，由于环状RNA这种高度保守的结构特性，以及吸附miRNA、调控基因表达、翻译蛋白质等功能，已有研究证实其可参与多种疾病的发生和发展，并有可能成为疾病的诊断和预后判断的新的标志物[6].

SLE是一种原发的严重的自身免疫性疾病，已证实60多个基因与SLE有关，miRNA通过引导mRNA降解或抑制mRNA翻译或转录过程来参与基因调控.而环状RNA可作为miRNA的 海绵，Memczak等[7]报道小脑变性相关蛋白酶1 (cerebellar degeneration-related protease 1，CDR1as)具有63个miR-7的结合位点，能有效地竞争性结合细胞内miR-7，作为内源性竞争RNA(ceRNA)参与小脑变性相关蛋白1(cerebellar degeneration-related protine 1，CDR1)的调控.CDR1具有抑制免疫力和促进炎症反应的作用，是自身免疫系统疾病的重要基因.喻祥琪等[8]在SLE病人血浆中筛选出大量差异表达的环状RNA，并对部分目标环状RNA进行验证，证实hsa_circ_0005314、hsa_circ_0007587与hsa_circ_00061891可通过调节miR_146a影响I型干扰素(Interferons，IFN)途径，从而参与SLE疾病的发生和发展.Li等[9]的研究发现hsa_circ_100226可能通过抑制miRNA水平影响靶基因Ets-1表达.Zhang等[10]的研究则推测hsa_circRNA_001308的表达下调可通过受转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)途径提高神经毡蛋白-1(Neuropilin-1，NRP-1)的水平在SLE疾病的发生中发挥作用.

本研究采用CIRCpedia数据库信息，通过前期大量的数据分析整理，筛选出9种候选环状RNA，应用RT-qPCR技术检测和验证表达差异，证实其中1种环状RNA：HSA_CIRCpedia_7637在SLE组明显下调，其所对应的SLC15A4基因的线性RNA也明显下调.HSA_CIRCpedia_7637，别名为hsa_circ_0006689，位于chr12：129293332-129299615，其功能和作用尚不清楚.SLC15A4基因是报道比较晚的SLE疾病相关性基因.SLC15A4编码的蛋白是一种肽组氨酸转运的通道蛋白，主要位于溶酶体、细胞质膜以及内含体等细胞器.有研究表明SLC15A4在Toll样受体9(Toll―Like receptor 9，TLR9)受体信号通路介导的免疫球蛋白分泌型转变为IgG 2c的效应途径中起重要作用[11]，还与哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)依赖的炎症反应和致病性抗体的分泌相关[12].本研究筛选出来的HSA_CIRCpedia_7637在其他同类型研究中未见报道，可能原因是筛选方法的不同，可作为基因芯片筛选方法的一个补充.而HSA_CIRCpedia_7637作为SLE诊断标志物的可能性也需要进一步证实.

基于信息学预测分析找出可能竞争性结合的miRNA是目前环状RNA功能研究中的常用方法.本研究找到了11种HSA_CIRCpedia_7637可能竞争性结合的miRNA，hsa-miR-638在SLE中存在表达增高情况[13-14].因此，假设HSA_CIRCpedia_7637作为ceRNA竞争性结合hsa-miR-638在健康人群中阻止hsa-miR-638发挥作用.在SLE患者中由于HSA_CIRCpedia_7637表达下降，hsa-miR-638上调导致SLE疾病.有研究证实hsa-miR-638能直接靶向抑制MAPK14的表达，负性调节机体的炎性反应[15].但hsa-miR-638在SLE中如何发挥作用尚未研究清楚.预测出来的另外10种miRNA与SLE的关系尚无报道，均可作为SLE疾病机制研究的切入点.

综上，SLE疾病相关性基因SLC15A4所对应的一种环状RNAHSA_CIRCpedia_7637在SLE患者中明显下调，且SLC15A4基因的线性转录也存在明显下调趋势，定量PCR检测验证表达差异.HSA_CIRCpedia_7637可能竞争性结合11种miRNA，作为hsa-miR-638的内源性负调控因子，在SLE患者中低表达，导致hsa-miR-638的升高，进而促进SLE疾病的发生发展.