选择性脑低温对脑缺血-再灌注大鼠皮质长链非编码RNA AK009271的影响

唐亚男 张高峰 王明山

选择性脑低温现已被证实能够通过减轻脑缺血-再灌注损伤(cerebral ischemia/reperfusion injury, CIRI)发挥脑保护作用[1]。本课题组前期研究结果表明，CIRI时，选择性脑低温能够下调线粒体分裂蛋白1(mitochondrial fission protein1, Fis1)的表达水平，稳定线粒体超微结构，抑制胞质中细胞色素C的释放，减少细胞凋亡从而发挥脑保护作用[2]。

长链非编码RNA(long non-coding RNA, LncRNA)是一类长度>200 nt，缺乏显著开放阅读框的RNA转录本，其在中枢神经系统中特异性高表达, 对中枢神经系统发育和疾病发展具有重要调控作用[3-5]。大量研究表明，CIRI时脑内多个LncRNA的表达发生改变，提示LncRNA可能在CIRI中发挥了关键作用[6-8]。Wang等[9-10]研究结果显示，在心肌细胞中LncRNA AK009271能通过调控Fis1的表达抑制线粒体分裂，进而减轻细胞凋亡。此外，通过查找NCBI Gene数据库,我们发现LncRNA AK009271在中枢神经系统内丰富表达。但LncRNA AK009271是否在CIRI时有差异性表达以及选择性脑低温能否通过影响LncRNA AK009271进而抑制Fis1介导的细胞凋亡通路发挥脑保护作用尚未明确。本研究拟建立大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)模型，并给予选择性脑低温处理，探讨其对CIRI大鼠皮质LncRNA AK009271的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

SPF级健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠75只，8周龄，体质量200～250 g，由青岛大任富城畜牧有限公司提供[许可证号：SCXKL(鲁)2014-007]。实验动物的操作及饲养均符合中华人民共和国《实验动物管理条例》[11]相关规定。具体动物饲养环境：温度18～24°C，湿度50%～60%，12 h昼夜交替，自由摄食饮水。 按照随机数字量表法，将所有动物随机分为假手术组(S组)、缺血-再灌注组(I/R组)、低温+缺血-再灌注组(HT组)，每组25只。

1.2 脑缺血-再灌注模型制备

采用Longa线栓法制备大鼠脑缺血-再灌注模型[12]。1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉(30 mg/kg)，将大鼠仰卧固定于实验台，常规颈前皮肤脱毛消毒，沿颈正中线剪开约3 cm的小口，分离并夹闭左侧颈总、颈内、颈外动脉，勿伤及迷走神经。剪断颈外动脉，将线栓沿颈外动脉至颈内动脉插入大脑中动脉，遇到阻力时停止，进线深度从颈总动脉分叉起18～20 mm，结扎颈外动脉近心端固定线栓，松开动脉夹。缝合切口，消毒。术中采用保温毯维持肛温37.0～37.2 ℃，采用激光多普勒血流仪(PeriFlux 5 000，Perimed，瑞典)监测局部脑血流的变化。大脑中动脉血流阻断2 h后，缓慢拔出线栓，实现再灌注。S组只分离血管，不做其他干预措施。所有大鼠完全苏醒后，参照Zea Longa评分法[12]进行5分制评分。评分标准：0分，无神经功能损伤症状；1分，提尾时对侧前肢无力蜷缩；2分，行走时向对侧旋转；3分，行走时向对侧倾倒；4分，不能自发行走，意识丧失。评分1～3分为造模成功。

1.3 选择性脑低温模型制备

参照文献[13]制备选择性脑低温模型。HT组拔出线栓即刻将PE-50灌注管经左侧颈外动脉插入颈内动脉5～10 mm，使用TERUMO微量泵泵注4 ℃等渗盐水15 min(20 ml/kg)入脑, 然后恢复血液灌注。术中持续采用BAT-12微探针温度计(Physitemp 公司，美国)监测脑温，电子体温计监测肛温。以脑温下降2～3 ℃而肛温保持不变为造模成功。

1.4 神经功能缺损评分

每组分别于再灌注6、24、48 h后随机取5只大鼠进行神经功能学评分，具体评分标准如上。

1.5 定量即时聚合酶链反应(quantitative real time polymerase chain reaction，qRT-PCR)测定LncRNA AK009271的表达

每组分别于再灌注6、24、48 h后随机取5只大鼠，处死后分离左侧脑皮质缺血半暗带置于-80 ℃保存。(1)取部分组织按照总RNA提取试剂盒(Takara公司，日本)说明提取总RNA，采用分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测RNA的纯度及浓度；(2)根据反转录试剂盒(Takara公司，日本)将总RNA反转录为cDNA，并保存于-20 ℃；(3)将cDNA按照qRT-PCR上机试剂盒(Takara公司，日本)配置PCR反应体系，并置于ABI 7300荧光实时定量聚合酶链反应仪(CA公司，美国)进行PCR。LncRNA AK009271上游引物：5′-GCAAAGGGTATGAAATGAATGTCTC-3′，下游引物：5′-CAACATCCCAACTCCACAACC-3′；内参GAPDH上游引物：5′-AATTCCATGGCACCGTCAAG-3′；下游引物：5′-TGGACTCCACGACGTACTC-3′。采用2-ΔΔCt[14]计算LncRNA AK009271的相对表达量，以GAPDH为内参。

1.6 Western Blot测定Fis1的表达

每组随机取5个再灌注24 h的脑皮质缺血半暗带样本，加入细胞裂解液和磷酸酶抑制剂(上海碧云天生物技术研究所)进行低温匀浆，二喹啉甲酸(bicinchoninic acid, BCA)法测定蛋白浓度。配制分别含10%和5%丙烯酰胺的分离胶和浓缩胶，加样(蛋白50 μg)进行电泳浓缩、分离，半干法转移至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride, PVDF)膜上，转膜完成后1×洗膜缓冲液(Tris buffered saline Tween, TBST) 冲洗，3%牛血清白蛋白室温封闭2 h，加入一抗(1∶1 000，Abcam公司，英国)，4 ℃孵育过夜。次日复温 1 h，1×TBST冲洗，加入辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶5 000，北京中杉金桥科技公司)，室温孵育3 h，1×TBST 冲洗，滴加化学发光剂，显影，保存图片，采用Image J软件(NIH公司，美国)进行分析，以Fis1条带灰度值与内参β-actin灰度值的比值反映Fis1表达水平。

1.7 电镜下观察线粒体超微结构

每组分别于再灌注24 h后随机取5只大鼠，麻醉后经心脏依次灌注0.9%等渗盐水和2%的戊二醛后断头取脑，分离缺血半暗带，用眼科剪将其剪成1 mm×1 mm×1 mm的小块，放入已预冷的25%戊二醛中固定，并置于4 ℃冰箱。检测时按常规电镜样本制备程序，制备50 μm厚的超薄切片，晾干、枸橼酸铅电子染色；透射电镜(Hitachi公司，日本)下观察，拍照。

1.8 细胞凋亡率测定

每组分别于再灌注24 h后随机取5只大鼠，麻醉后经心脏依次灌注0.9%等渗盐水和4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液，分离大脑皮质缺血半暗带后常规固定、梯度酒精脱水、二甲苯透明、石蜡包埋，连续5 μm厚冠状切片，烤片后4 ℃储存备用。采用原位末端标记法(terminal deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL)染色，具体步骤按照TUNEL试剂盒(Merck公司，德国)说明书进行。常规脱蜡水化，二氨基联苯胺(diaminobenzidine, DAB)显色，400倍光镜下，每个脑组织随机选取3个脑片，每个脑片随机选取不重叠的5个视野，人工计数凋亡细胞个数及细胞总数，计算平均值即为细胞凋亡率。细胞核中TUNEL阳性细胞表现为棕黄色颗粒，即凋亡细胞。细胞凋亡率=凋亡细胞计数÷总细胞计数×100%。

1.9 统计学分析

2 结果

2.1 温度

与I/R组比较，HT组4 ℃等渗盐水灌注15 min时脑温下降(P<0.05)，肛温差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 两组大鼠缺血-再灌注(血液/4 ℃等渗盐水)15 min时温度监测结果比较

注：I/R组为缺血-再灌注组，HT组为低温+缺血-再灌注组

2.2 神经功能缺损评分

S组神经功能缺损评分为0分；与S组比较，I/R组和HT组再灌注各时点神经功能缺损评分升高(均P<0.05)；与I/R组比较，HT组再灌注各时点神经功能缺损评分降低(均P<0.05)。见图1。

2.3 各组LncRNA AK009271表达的比较

与S组比较，I/R组再灌注各时点LncRNA AK009271表达降低(均P<0.05)；随着再灌注时间的增加，LncRNA AK009271的表达发生改变，且再灌注24 h LncRNA AK009271的表达最低(P<0.05)，因此确立再灌注24 h用于后续实验的时间点；与S组比较，HT组再灌注各时点LncRNA AK009271的表达降低(均P<0.05)；与I/R组比较，HT组再灌注各时点LncRNA AK009271的表达增加(均P<0.05)。见图2。

2.4 各组Fis1表达的比较

与S组比较，I/R组和HT组再灌注24 h Fis1的表达增加(均P<0.05)；与I/R组比较，HT组再灌注24 h Fis1表达降低(P<0.05)。见图3,4。

2.5 各组线粒体超微结构的比较

电镜下观察线粒体超微结构(箭头所示)，显示再灌注24 h后，S组线粒体形态正常，多呈圆状或杆状，双层膜结构完整，未出现肿胀和空泡变性；I/R组可见大量线粒体肿胀变圆，部分可见嵴断裂和空泡化现象；HT组线粒体形态破坏程度较I/R组轻，线粒体分布较均匀，嵴尚清晰且排列尚可，仅可见少量线粒体肿胀和空泡变性。见图5。

2.6 各组细胞凋亡率的比较

TUNEL染色后，S组大鼠细胞核几乎呈蓝色，极少呈棕黄色或棕褐色，即凋亡细胞(箭头所示)；I/R组和HT组大鼠再灌注24 h后，黄染细胞核即凋亡细胞明显增多；在经过选择性脑低温处理后，与I/R组比较，HT组黄染细胞核减少。细胞凋亡率比较结果显示，与S组比较，I/R组和HT组再灌注24 h细胞凋亡率明显增加(均P<0.05)；与I/R组比较，HT组再灌注24 h后细胞凋亡率降低(P<0.05)。见图6，7。

3 讨论

近年来研究结果表明，LncRNA的失调与人类疾病密切相关，目前LncRNA的研究覆盖了神经系统疾病、心脑血管疾病、肿瘤等疾病的病理生理过程[15-16]。在缺血性卒中方面，Dharap等[17]研究发现，局部脑缺血后诱导脑内一系列LncRNA表达模式的改变，表明LncRNA可能在缺血性卒中的病理生理过程中有着重要作用。

细胞凋亡是CIRI后神经细胞死亡的重要途经[18-20]。Fis1是一种锚定在线粒体外膜上的相对分子量17 000的适配蛋白，其通过募集胞浆中的动力而相关蛋白1至线粒体外膜介导线粒体的分裂[21]，线粒体过度分裂会导致线粒体超微结构改变，引起线粒体膜通透性增加和促凋亡蛋白-细胞色素C释放，激活凋亡级联反应，并最终导致细胞凋亡，加重神经功能损伤[22]。Fis1过表达时线粒体分裂和细胞凋亡增加；反之，Fis1缺失时线粒体分裂和细胞凋亡受到抑制[23-24]。Wang等[9-10]研究发现，LncRNA AK009271可以负向调控Fis1的表达，进而抑制Fis1介导的线粒体分裂和细胞凋亡通路。但缺血性卒中时，LncRNA AK009271的表达模式是否发生变化尚未有明确研究。因此，本研究采用Longa线栓法栓塞大脑中动脉制备大鼠脑缺血-再灌注模型，该模型可以较好地模拟缺血性卒中的病理生理变化。结果表明，CIRI时，大鼠皮质缺血半暗带区LncRNA AK009271的表达明显下调，且在再灌注24 h差异性表达最明显。

低温由于其具有脑保护作用而得到广泛关注。选择性脑低温是一种保持核心温度不变，选择性降低脑组织温度的低温方法，其与全身性低温相比，降温速度快、不良反应少，更适合用于缺血性卒中后的脑保护[1]。本研究参照文献[13]于再灌注即刻行颈内动脉灌注4 ℃等渗盐水15 min(20 ml/kg)，低温液体经颈内动脉进入大脑中动脉后通过Willis环迅速实现全脑降温，并在手术过程中监测脑温和肛温。结果表明，选择性脑低温模型成功构建，且在经过选择性脑低温处理后，大鼠神经功能缺损评分降低，提示选择性脑低温具有脑保护作用。此外，本课题组前期研究结果表明[2]，选择性脑低温能够通过下调Fis1的表达，抑制线粒体分裂和凋亡，从而减轻CIRI发挥脑保护作用。但选择性脑低温是否通过调节LncRNA AK009271的表达进而调控Fis1的水平尚未有明确研究。

本研究采用qRT-PCR测定了大鼠皮质脑缺血半暗带区LncRNA AK009271的表达，结果表明，CIRI时LncRNA AK009271的表达明显下调，且在再灌注24 h最明显；而在经过选择性脑低温处理后，LncRNA AK009271的表达明显上调，提示LncRNA AK009271可能参与了CIRI的病理生理过程，且低温脑保护作用可能与其相关。此外，为了探讨LncRNA AK009271-Fis1-细胞凋亡通路是否参与了低温脑保护作用，本研究选取CIRI时LncRNA AK009271差异性表达最显著的时间点进一步测定了大鼠皮质脑缺血半暗带Fis1的表达及细胞凋亡，并在电镜下观察了线粒体超微结构。结果表明，LncRNA AK009271在I/R组的表达明显低于S组，而Fis1的表达及细胞凋亡明显增加，线粒体超微结构损伤严重；与此相反，LncRNA AK009271在HT组的表达明显高于I/R组，而Fis1的表达及细胞凋亡明显下降，线粒体超微结构损伤较轻。这提示选择性脑低温可能通过调节LncRNA AK009271的表达进而调控Fis1介导的细胞凋亡通路发挥脑保护作用。

综上所述，选择性脑低温可能通过上调LncRNA AK009271的表达，进而抑制Fis1的表达，稳定线粒体超微结构，减轻细胞凋亡，从而改善CIRI大鼠的神经功能。但选择性脑低温调控LncRNA AK009271通路的具体机制仍需进一步研究，以期待未来能够发现治疗缺血性卒中的新靶点。