基于PI3K/Akt/mTOR 信号通路研究南葶苈子水提液对心力衰竭模型大鼠心室重构的影响

杨 明 董竹琴 罗 颖 孙志强 林冬铭 黄抒伟

心力衰竭是各种心脏结构或功能性疾病导致心室充盈及（或）射血能力受损而引起的一组临床综合征，常表现为呼吸困难、乏力和体液潴留[1]，属中医“心悸”、“痰饮”、“水肿”等范畴。南葶苈子为十字花科 植 物 播 娘 蒿Descurainia sophia （L.）Webb. ex Prantl.（DSW）的干燥成熟种子，具有强心、利尿、止咳和抑制炎症渗出等作用[2]。既往研究表明，南葶苈子水提液能改善压力后负荷所致的心室重构从而改善心功能[3]，但具体机制尚不明确，可能与抑制肾素-血管紧张素-醛固酮系统（RAAS）和交感神经激活有关[4-5]。我们通过大鼠心超等前期实验也证实，南葶苈子水提液具有抑制心室重构、改善心功能的作用[6]。本实验延续腹主动脉不完全结扎制造大鼠慢性心衰模型，基于PI3K/Akt/mTOR 信号通路进一步探讨南葶苈子水提液改善心衰大鼠心室重构的相关机制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF 级雄性SD 大鼠15 只，体质量（220±10）g，由浙江中医药大学动物实验研究中心提供，动物生产单位为上海西普尔必凯实验动物有限公司，许可证号：SCXK（沪）2013-0016。大鼠饲养环境温度为18～29℃，日温差≤3℃，相对湿度达40%～70%，新鲜空气换气次数10 次/h，气流速度≤0.18m/s，压差25Pa，洁净度一万级，噪音≤60dB，照度150～300Lux。试验中所有实验动物饲养、使用和操作均按3R 原则给予人道关怀。

1.2 主要药物和试剂 南葶苈子由浙江中医药大学提供，取南葶苈子200g，8 倍量70℃水浴提取3 次，每次1h，合并滤液浓缩至100mL 备用，每1mL 相当于2g 原生药。广谱磷酸酶抑制剂混合物（货号AR1183）和荧光二抗（货号BA1020）均购自博士德生物工程有限公司；Cleaved-caspase-3 抗体（货号9662S）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）抗体（货号5174S）、B 淋巴细胞瘤-2 蛋白（Bcl-2）抗体（货号3498S）、Bcl-2 相关x 蛋白（Bax）抗体（货号2774S）、蛋白激酶B（Akt）抗体（货号9272S）、磷酸化蛋白激酶B（p-Akt）抗体（货号4685S）、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）抗体（货号2971S）、磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（p-mTOR）抗体（货号2972S）均购自Cell Signaling Technology 公司；超敏化学发光（Ultra ECL）试剂盒购自杭州联科生物技术股份有限公司（批号A8262103V）。

1.3 动物分组和模型建立 15 只SD 大鼠按随机数字表法分为正常组、模型组和南葶苈子组，每组5只。正常组及模型组大鼠给予5mL·kg-1·d-1生理盐水灌胃，葶苈子组大鼠给予南葶苈子水提液10g·kg-1·d-1灌胃，SD 大鼠动物模型建立后各灌胃4 周。SD 大鼠用10%水合氯醛腹腔麻醉，剑突下腹正中偏左0.5cm切口，打开腹腔，钝性游离腹主动脉，将一个去掉针尖的8 号注射针头紧贴腹主动脉平行放置并用4 号线一起结扎，轻轻抽出针头，使腹主动脉截面积缩窄为原来的50%～60%，撒少许青霉素粉后关腹，分层缝合。

1.4 检测指标及方法

1.4.1 心室肥厚指数 大鼠处死后，打开胸腔，迅速分离大鼠心脏，剪去心室底部血管及心房组织，用生理盐水冲洗心腔内残留血液，滤纸吸干水分，电子分析天平秤取心室重量，计算心室肥厚指数。心室肥厚指数=心室质量（g）/大鼠体质量（g）。

1.4.2 病理组织形态学检测 取左心室心肌标本，置于4%甲醛中固定24h，经取材、脱水、石蜡包埋处理后，沿左心室长轴线取4μm 厚度切片，HE 染色后光学显微镜下观察心肌组织形态学变化。

1.4.3 电镜观察 取左心室心肌组织，4℃下用2.5%戊二醛固定过夜，然后用磷酸盐缓冲液洗涤3 次，用1%四氧化锇固定2h。使用未涂布的铜网格上的超小型标准程序获得3 个超薄切片，并用0.2%柠檬酸铅/1%乙酸铀酰染色。通过透射电子显微镜（JOEL-1400EX，日本东京）记录图像，放大倍数20000×观察。

1.4.4 Western Blot 法检测 取大鼠左心室心肌组织标本液氮研碎，加入裂解液，经匀浆离心后，取上清液用BCA 法测定蛋白浓度，变性后-20℃保存。取各组样本50μg，进行12%SDS-PAGE 并湿转至PVDF 膜上，用3%BSA 室温摇床封闭2h，加入3%封闭液稀释的抗体（1：1000 稀释），4℃冷库摇床过夜，用TBST 洗涤15min×3 次。然后，加入二抗（1：2000 稀释），室温下摇床孵育2h 后，用TBST 洗涤15min×3次。ECL 发光液显色，胶片扫描后用Imgae J 软件进行图像分析，以GAPDH（1：1000 稀释）作为内参照对比，比值结果表示其蛋白的相对含量。

1.5 统计学方法 应用SPSS 22.0 统计软件分析，计量资料用均数±标准差（±s） 表示，采用单因素方差分析，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠一般情况比较 模型组大鼠造模后出现活动量下降，呼吸稍急促，4 周后体质量较正常组明显下降（P＜0.05），南葶苈子组大鼠体质量较模型组有所增加（P＜0.05）。4 周后，模型组大鼠较正常组心室增重，心室肥厚指数升高，南葶苈子组大鼠心室重量、心室肥厚指数较模型组降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

2.2 心室组织病理结果 正常组大鼠心肌纤维组织排列规则，心肌纤维无明显断裂。模型组大鼠心肌纤维排列不规则，且出现纤维断裂、肥厚现象，组织间隙伴有炎性细胞浸润。南葶苈子组与模型组比较，上述情况明显改善。见插页图1。

表1 各组大鼠体质量、心室质量及心室肥厚指数比较（±s）

表1 各组大鼠体质量、心室质量及心室肥厚指数比较（±s）

注：与正常组比较，*P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05；正常组及模型组大鼠给予生理盐水灌胃，南葶苈子组大鼠给予南葶苈子水提液灌胃

组别正常组模型组南葶苈子组鼠数555体质量（g）313.70±7.57 285.03±5.39*295.13±5.39△心室质量（g）0.92±0.28 1.07±0.05*0.96±0.09△心室肥厚指数0.0029±0.0001 0.0037±0.0001*0.0033±0.0002△

2.3 心室组织电镜结果 正常组大鼠心肌纤维排列整齐，z 线清晰均匀，线粒体嵴紧密有序。模型组大鼠心肌纤维排列紊乱，z 线消失，甚至破裂；线粒体数量增加，但形态不一，膜结构不清、融合甚至消失；可观察到线粒体空泡化和肿胀。南葶苈子组与模型组比较，这些病理改变明显改善。见插页图2。

2.4 各组大鼠左心室心肌组织蛋白表达比较 与正常组比较，模型组大鼠心肌组织Bax 和Caspase-3 蛋白表达上调，Bcl-2 蛋白表达下调；与模型组比较，南葶苈子组大鼠心肌组织Bcl-2/Bax 表达上调，caspase-3 蛋白表达下调（P 均＜0.05）；与模型组比较，南葶苈子组大鼠心肌组织p-Akt/Akt 和p-mTOR/mTOR 蛋白表达上调（P＜0.05）。见表2、插页图3。

3 讨 论

研究表明，高血压的主要靶器官（心、脑、肾）中均存在细胞凋亡现象[7]，且心肌细胞凋亡已被证明可发生在心力衰竭心脏中[8]，许多心衰进展的病理生理因素，如儿茶酚胺、血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）、活性氧（ROS）、一氧化氮（NO）、炎症因子和机械压力等均可促进心肌细胞凋亡[9]。南葶苈子含有牛磺酸成分，具有抗氧化、调节儿茶酚胺及AngⅡ的水平[10]，改善心脏能量代谢的作用[11]。南葶苈子亦可通过利尿排泄肾脏毒性物质（如硫酸盐）间接抑制心肌细胞凋亡和改善心室肥厚[2]。

细胞凋亡是一种程序性细胞死亡[12]，Bcl-2 家族和caspase 家族在细胞凋亡转导途径中起着非常重要的调节作用，尤其是在线粒体途径中。Bcl-2 和Bax 基因家族是线粒体膜通透性改变的重要调节基因，其过表达可以控制上游cyt-c 的释放和下游caspase-3 蛋白酶的活化并介导细胞凋亡[13]。本研究通过电镜证实南葶苈子组心肌细胞线粒体损伤减轻。Western blot 结果显示，与模型组比较，南葶苈子组大鼠心肌组织Bcl-2/Bax 蛋白表达上调，caspase-3蛋白表达下调，说明南葶苈子水提液可能是通过Bcl-2/Bax 介导的线粒体凋亡信号传导途径抑制心肌凋亡。

表2 各组大鼠心肌组织蛋白灰度值比较（x±s）

哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian aarget of rapamycin，mTOR）是一种进化上相对保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，可通过磷酸化其下游的靶蛋白，参与基因的转录和蛋白的表达，进而影响凋亡等生物活性。而相关细胞因子又可通过受体酪氨酸激酶激活PI3K，活化的PI3K 催化磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸（PIP2）转化为PIP3，并在3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1（PDK1）的协同下磷酸化Akt 使其激活。活化的Akt 磷酸化TSC2，而被磷酸化的TSC2 将阻止其对小G 蛋白Rheb 的负调控，从而正向调控mTOR 活性[14]。本研究结果证实，随着压力后负荷性心衰模型的进展，南葶苈子组较模型组p-Akt/Akt 和p-mTOR/mTOR 蛋白表达上调（P＜0.05），凋亡蛋白caspases-3表达下调，说明南葶苈子提取液抑制心肌细胞凋亡可能与激活PI3K/Akt/mTOR 信号通路有关。

综上所述，本研究证实南葶苈子能有效改善压力负荷性心衰大鼠心室重构，作用机制可能与激活PI3K/Akt/mTOR 信号通路抑制心肌细胞凋亡有关。本研究的局限性在于缺乏原代心肌细胞实验，未使用mTOR 抑制剂雷帕霉素反向验证南葶苈子抑制心肌细胞凋亡是通过PI3K/Akt/mTOR 信号通路介导。另外，由于本研究样本量较小，为了验证本研究结论的准确性，可能需要进一步扩大样本量进行进一步研究。