Orbitrap-Elite高分辨质谱用于减肥及壮阳类保健食品和中成药中54种非法添加物的快速筛查及确证

黄泽玮　刘忠莹　黄瑛　杜钢　贺亚玲

摘要：建立基于Orbitrap-Elite高分辨质谱的快速筛查及确证减肥及壮阳类保健食品和中成药中54种非法添加物的方法。采用Hypersil GOLD C18 column色谱柱（150mm×2.1mm，1.9μm），梯度洗脱，流量0.3mL/min，正离子全扫描/数据依赖的二级扫描模式，在28min内完成54种目标化合物的分离和高精度一级、二级质谱扫描，并通过Exact Finder 2.0软件进行快速筛查，以确证样品中是否掺加减肥及壮阳类化学药物。结果显示在28min内54种化合物能得到较好分离;6种基质加标溶液中54种化合物的一级与二级离子精确质量数的实测值与理论值均在5×10^-6误差之内;空白溶液中54种化合物结果均为阴性;20批减肥及壮阳类保健食品及中成药样品中检出1批阳性样品，阳性率5%0该方法操作简单快捷，结果定性准确，无假阴性和假阳性情况出现，可用于减肥及壮阳类保健食品和中成药中54种非法添加的高通量快速筛查及确证。

关键词：Orbitrap-Elite高分辨质谱;非法添加;快速筛查;减肥;壮阳

中图分类号：O657.63 文献标志码：A 文章编号：1674-5124（2019）01-0070-07

0 引言

近年来，随着社会经济的发展和人们生活水平的提高，人们对保健食品及中成药的需求与日俱增，其中减肥及壮阳类相关产品尤其受到人们的青睐。然而这一类产品中检出非法添加的情况时有发生。近年来许多不法商家为谋取暴利，在该类产品中添加化学成分，为消费者埋下了健康隐患。因此，为严厉打击非法添加行为，保证人民群众的生命安全，需要开发快速、准确、高选择性的方法用于减肥及壮阳类非法添加的检测。

目前常用的非法添加检验方法主要有薄层色谱法[1]、液相色谱法[2-3]和低分辨液质联用法[4-5]，其存在选择性差、干扰多、定性能力弱等缺点。Orbitrap是近20多年来质谱分析器的突破性技术，通过静电场轨道肼方式提供高质量分辨能力和精确质量数[6]，可在有限的时间范围对数量庞大的化合物进行筛查。其最高分辨率可达24万以上，质量精度可达10^-7～10^-6。有报道使用Orbitrap高分辨质谱对降糖类中成药和保健食品中的非法添加化学药物[7]以及动物肌肉中的β2受体激动剂[8]进行检测。本文将Orbitrap-Elite高分辨质谱技术用于减肥及壮阳类保健食品及中成药中54种非法添加物的快速筛查及确证。通过全扫描/数据依赖二级扫描（FullMS/dd-MS²）模式，在28min内完成对样品的分离和高精度一级、二级扫描，并通过Exact Finder2.0软件进行快速筛查和确证。本方法具有快速、准确、高选择性的特点，为打击日益猖撅的非法添加行为提供了新手段。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Orbitrap-Elite高分辨质谱联用仪（Thermo FisherScientific），装配有HESI-II源：Dionex Ultimate 3000超高效液相色谱（Thermo Fisher Scientific）。

1.2 对照品

鹽酸苯丙醇胺、盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、盐酸甲基麻黄碱、盐酸安非他酮、盐酸芬氟拉明、盐酸氟西汀、盐酸西布曲明、辛伐他汀、非诺贝特来源于中国药品生物制品检定所;安非他明硫酸盐、盐酸甲基安非他明、吲达帕胺、酚酞、盐酸N，N-双去甲基西布曲明、盐酸N-单去甲基西布曲明、比沙可啶、洛伐他汀、奥利司他、烟酸、茶碱、那红地那非、红地那非、氨基他达拉非、西地那非、硫代艾地那非、伪伐地那非、那莫西地那非来源于中国食品药品检定研究院;盐酸氯卡色林、布美他尼、利莫那班盐酸盐、盐酸去甲氟西汀、美伐他汀、洛伐他汀羟酸钠盐、西立伐他汀钠、氟伐他汀钠、依替米贝、阿伐麦布、盐酸去甲芬氟拉明、琉基西地那非、去甲基他达拉非来源于Toronto Research Chemicals INC.;苄基西布曲明盐酸盐、盐酸豪莫西布曲明、盐酸氯代西布曲明、他达拉非、羟基豪莫西地那非、盐酸伐地那非、硫代豪莫西地那非、乌地那非、二甲基西地那非、羟基硫代豪莫西地那非来源于TLC PharmaChem;去甲伪麻黄碱盐酸盐、分特拉明来源于SIGMA-Alorch company;左旋肉碱来源于LGC Gmbh;纯度均>94%。1.3试剂及耗材

甲醇、甲酸铵（色谱级）：Fisher Chemical;甲酸（优级纯）：Anpel;Pierce^TMLTQ Velos ESI PositiveIon Calibration Solution（质谱校正液：含有咖啡因，MRFA，Ultramark 1621，正丁胺）：Thermo FisherScientific;20批保健食品及中成药样品：四川省食品药品检验检测院市场抽样。

2 方法与结果

2.1 测定方法与数据处理

2.1.1 色谱条件

色谱柱：Hypersil GOLD C18 column（150mm×2.1mm，1.9μm），Thermo Fisher Scientific：流量0.3mL/min;流动相为5mmol/L的甲酸铵溶液（A相，含0.1%甲酸）-0.1甲酸甲醇（B相）;梯度洗脱：0min（95：5）→4min（95：5）→10min（60：40）→14min（60：40）→16min（40：60）→17min（5：95）→25min（5：95）→25.1min（95：5）→28min（95：5）;柱温：35℃;进样量：2μL。

2.1.2 质谱条件

采用HESI-Ⅱ源（正离子模式），喷雾电压为3.6kV，毛细管和雾化器温度均为350℃。鞘气和辅助气分别为4.5L/min和6.5L/min，S-lens RF level为60%。雾化气为氮气，碰撞气为氦气。使用质谱校正液5d校正1次质量轴。扫描方式采用全扫描/数据依赖的二级扫描（Full MS/dd-MSZ）模式，此模式包含1次全扫描（分辨率30000）和1次数据依赖的二级扫描（分辨率15000）。一级全扫描范围为100～700m/z，自动增益控制和离子注人时间分别设为1.0×10⁶和100ms;数据依赖的二级扫描（dd-MS²）使用动态排除（Dynamic Exclusion）功能，具体参数：Repeat count设为2，Repeat duration设为4.0s，Exclusion list size设为500，Exclusion duration设为6.0s：Minimum signal threshold设为1000count;Analyze top N peaks设为10;Activation type设为CID：Isolation window设为2.0m/z;ActivationQ设为0.250;Activation time设为10.00ms;针对每个目标化合物分别设置最佳归一化碰撞能量，详见表1。

2.1.3 数据处理

使用Exact Finder 2.0软件进行数据处理。将54种化合物的保留时间、一级精确质量数和二级碎片离子精确质量数录入软件，形成数据库，用于定性筛查和确证：在Screening Method中设置目标化合物数据库：以化合物保留时间和一级精确质量数作为筛查依据，以二级碎片离子精确质量数作为确证依据;样品与对照品的一级及二级离子精确质量数偏差应≤5×10^-6，峰阈值、S/N信噪比阈值分别设为400和5;保留时间窗设置为15s。

2.2 溶液配制

2.2.1 混合对照品溶液

精密称取54种化合物的对照品各约10mg，分别置于25mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，作为各对照品储备液。分别精密吸取各对照品储备液适量，置于同一100mL量瓶中，用流动相稀释并定容至刻度，作为混合对照工作液。

2.2.2 供试品溶液

固体制剂（胶囊取内容物）：研磨均匀后，精密称取1g，置于10mL量瓶中，加甲醇约8mL，超声30min，放置至室温，用甲醇稀释至刻度，摇匀，过0.22μm微孔滤膜，即得。液体制剂：精密称取1g，置于10mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，过0.22μm微孔滤膜，即得。

2.3 结果

空白溶液的总离子流图如图1所示，在12.16，14.55min虽有峰出现（其一级质谱图分别见图2，图3），但是其一级质谱对各化合物的检测无干扰。混合对照品工作液中54种化合物的总离子流图如图4所示，分析物峰形良好，54种化合物均能得到较好分离。其中6组同分异构体均能通过保留时间进行区分。单次测定在28min内可完成54种化合物的筛查，通过Exact Finder进行数据处理分析效率高。化合物保留时间、一级与二级离子准确质量数和最佳归一化碰撞能量如表1所示。可观察到对照品溶液中54种化合物的实测与理论质量数偏差均小于5×10^-6，显示了Orbitrap-Elite高分辨质谱高度可靠的质量精度。

以甲醇逐级稀释各混合对照品储备液，精密吸取2μL进样。在进样浓度尽可能低的情况下，以保证连续三针进样定性正确（实测一级精确质量数和二级碎片精确质量数与理论质量数的偏差均≤5×10^-6）来确定检出限;检出限的结果见表1，54种化合物的检出限均小于10μg/g;以进样六针检出限溶液中各化合物峰面积的RSD表示精密度，精密度RSD（详见表1）均小于20%。

选择阴性的保健食品及中成药（包括片剂、胶囊剂、茶剂、酒、颗粒剂、咖啡）共6种基质，分别称取样品1g，精密量取对照品储备液适量，使供试品溶液最终浓度为各化合物检出限浓度，与供试品溶液同法制备后进样测定。经Exact Finder数据处理结果显示，六种基质加标溶液中54种化合物的一级与二级离子精确质量数的实测值与理论值均在5×10^-6误差之内，无假阴性情况。同时进行空白试验，54种化合物结果均为阴性，无假阳性情况。

2.4 方法的应用

将建立的方法用于非法添加检测工作。所筛查的化合物基本囊括了现有国家标准对壮阳类和减肥类非法添加的化合物种类，另外还增加了部分壮阳或减肥作用的化合物以扩大筛查范围。样品按“2.2.2”项方法处理后，进样2μL，Orbitrap-Elite高分辨质谱检测，得到数据在Exact Finder 2.0软件进行快速筛查和确证。在20批减肥及壮阳中成药和保健食品中共检出1批阳性样品。阳性率5%，检出的非法添加物为西布曲明，总离子流图见图5，西布曲明一级质谱图见图6，西布曲明二级碎片离子图见图7。按照BJS201701《食品中西布曲明等化合物的测定》对阳性结果进行验证，定性结果与本方法一致。

3 讨论

3.1 同分异构体

54种目标化合物中存在6组同分异构体。其中三组为光学异构体（苯丙醇胺（5.5min）-去甲伪麻黄碱（6.2min），麻黄碱（7.5min）-伪麻黄碱（7.7min），甲基安非他明（9.0min）-分特拉明（9.4min）），其一级与二级碎片精确质量数均一致，在定性上需要通过保留时间来区分，因此在梯度洗脱的设计上，前10min采用较缓的梯度（0min（95：5）→4min（95：5）→10min（60：40））以保证上述光学异构体在色譜行为上做到彻底分离，相互不干扰;另外还存在3组同分异构体（伪伐地那非（18.2min）-那莫西地那非（18.9min），伐地那非（11.6min）-二甲基西地那非（12.5min），硫代艾地那非（16.9min）-硫代豪莫西地那非（17.2min）），在保留时间不同的同时，选择定性离子时避免选择相同质量的碎片离子，以保证定性的准确性。

3.2 实验参数的优化

研究对比了Thermo Hypersil GOLD C18 column（2.1mm×150mm，1.9μm）、Thermo Acclaim RSLCC18（2.1mm×100mm，2.2μm）、Agilent ZORBAXEclipse XDB-C8（2.1mm×50mm，1.8μm）等色谱柱对待测化合物的分离效果。最终选择Thermo HypersilGOLD C18 column（2.1mm×150mm，1.9μm）色谱柱，其对于中段出峰密集阶段（10～16min）也可以做到所有化合物基本分离，且峰形良好。

在Full MS/dd-MS²扫描模式中，当全扫描数据中出现与目标化合物一级精确质量数相匹配的质量数时触发二级扫描，按照各化合物给定的最佳归一化碰撞能量进行二级碎裂，获得的二级碎片离子作为确证离子，用于确证化合物的定性。使用FullMS/dd-MS²数据扫描可减少非目标信息的采集，提高目标信息的准确度和分辨率。其中还使用了动态排除功能，其作用是某一信号在4s内被扫描到2次后，将信号放进排除列表，在接下来的6s内若再扫描到该信号不再进行二级碰撞，其意义在于避免响应高化合物的重复扫描，增加扫描的化合物个数，尤其是响应相对较低的化合物。

通过查阅文献[9-12]，在非法添加分析中，普遍采用有机试剂+超声提取的方式前处理。常用的有机溶剂便是甲醇、乙腈和一定比例的甲醇和水，故考察了甲醇、乙腈、50%甲醇的提取效果，结果发现3种溶剂提取后，各化合物的回收率无显著差异;通过对阳性样品的提取比较，结果无明显差异。考虑操作方便、成本、环保和对实验人员的健康影响（乙腈毒性比甲醇大）等因素，选择甲醇作为提取溶剂。

3.3 检出限的确定

从非法添加的角度，一般都会超量添加化学成分，从药效学角度出发，太低的添加浓度也不具有药效学意义;另外若使用3倍信噪比的方式来确定检出限，本方法检出限会降低至现有水平的百分之一～千分之一，但是在这样的检出限水平下，即使是纯对照品溶液，也可能会出现假阴性的情况。因此本实验中，一方面所确定的检出限均能满足各化合物最低起效剂量，另一方面通过在进样浓度尽可能低的情况下，以保证连续三针进样定性正确来确定检出限。这种方式能有效保证定性结果的准确性，避免出现假阴性。

4 结束语

本文将Orbitrap-Elite高分辨质谱技术用于保健食品及中成药中的减肥及壮阳类化学药物的快速筛查和确证。采用Full MS/dd-MS²模式，在28min内完成对样品中分析物的分离和高精度一级、二级扫描，并以Exact Finder 2.0软件进行快速筛查和确证。方法操作简单快捷、结果定性准确，无假阴性和假阳性情况出现。在20批减肥及壮阳类保健食品及中成药中检出1批阳性样品，阳性率为5%。Orbitrap-Elite高分辨质谱具有快速、准确、高选择性的特点，为打击日益猖撅的非法添加行为提供了新工具、新技术。

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