脑红蛋白在糖尿病大鼠视网膜病变发展中的表达变化

刘琼　于健　陈林江

【摘要】 目的 探讨脑红蛋白（NGB）在糖尿病大鼠视网膜病变发展中的表达变化。方法 30只雄性SD大鼠， 随机分为糖尿病组（DR组）和正常对照组（N组）， 每组15只。DR组大鼠腹腔注射链脲佐菌素STZ构建糖尿病大鼠动物模型。采用原位杂交法、免疫组化、蛋白质印迹法（Western blotting）检测NGB表达变化和分布特点。结果 诱导12周后， DR组大鼠体重为（309.0±11.0）kg， 明显轻于N组的（584.1±25.4）kg， 血糖为（30.1±5.4）mmol/L， 明显高于N组的（7.5±5.3）mmol/L， 差异均有统计学意义（P<0.05）。DR组视网膜组织NGB表达增加， 明显高于N组， 差异有统计学意义（P<0.01）。原位杂交示DR组神经节细胞层、内核层、外核层、光感受器层可见强阳性表达。结论 在糖尿病大鼠视网膜病变发展过程中， NGB可能参与视网膜的神经保护。

【关键词】 脑红蛋白;视网膜;糖尿病

【Abstract】 Objective To discuss the expression changes of neuroglobin （NGB） in the development of diabetic rat retinopathy. Methods A total of 30 male SD rats were randomly divided into diabetic group （DR group） and normal control group （N group）， with 15 rats in each group. In DR group， streptozotocin STZ was injected intraperitoneally to establish diabetic rat model. The expression and distribution characteristics of NGB were detected by in situ hybridization， immunohistochemistry and Western blotting. Results After 12 weeks of induction， DR group had obviously lighter rat weight as （309.0±11.0） kg than （584.1±25.4） kg in N group， and obviously higher blood glucose as （30.1±5.4） mmol/L than （7.5±5.3） mmol/L in N group. Their difference was statistically significant （P<0.05）. DR group had expression of NGB in retina of increased by 55.68% compared with that of N group， and the difference was statistically significant （P<0.01）. Situ hybridization showed strong positive expression in ganglion cell layer， inner nuclear layer， outer nuclear layer and photoreceptor layer of DR group. Conclusion NGB may be involved in retinal neuroprotection during the development of diabetic rat retinopathy.

【Key words】 Neuroglobin; Retina; Diabetes

脑红蛋白（neuroglobin， NGB）是一种主要分布于脑和视网膜中的特异性携氧球蛋白， 具有储存氧气和促进氧气向线粒体扩散或直接介导氧气向线粒体传递， 促进腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）的产生， 维持神经元正常功能[1]。有研究表明， NGB在视网膜中表达远高于其他神经组织， 其浓度约为脑内浓度的50～100倍[2]， 而视网膜又是人体内耗氧率最高的组织[3]， 这提示NGB可能与视网膜的氧利用密切相关。糖尿病视网膜病变目前成为主要的致盲疾病之一， 血糖升高导致视网膜血管内皮细胞受损， 周细胞凋亡， 继而引起视网膜血管渗漏， 视网膜组织水肿， 视网膜缺血缺氧诱发新生血管因子形成， 最终引起视网膜玻璃体出血导致患者视力严重受损。因此， NGB作为视网膜的特异性携氧蛋白是否参与糖尿病视网膜病变的发展是本研究的主要内容。

1 材料与方法

1. 1 材料来源 选取30只雄性SD大鼠（由南方医科大学实验动物中心提供）， 体重200～220 g， 大鼠分笼饲养， 无限制标准鼠食、水饲养， 饲养环境通风， 室温18～25℃， 相对湿度在50%～70%， 12 h光照昼夜循环。将30只SD大鼠随机分为正常对照组（N组）和糖尿病组（DR组）， 每组15只。

1. 2 方法

1. 2. 1 动物模型制备 DR组大鼠禁食12 h后， 腹腔注射链脲佐菌素STZ（sigma 公司）60 mg/kg， 注射1 d后经鼠尾静脉采血检测清晨血糖水平， 每周检测1次， 至12周。血糖 >15 mmol/L为糖尿病大鼠模型建立成功。

1. 2. 2 免疫组化 12周后， 过量戊巴比妥腹腔注射处死大鼠， 4%多聚甲醛灌注固定后取出眼球， 4%多聚甲醛后固定2 h后， 移至30%蔗糖溶液中4℃过夜沉底， 次日常规石蜡包埋， 切片。石蜡包埋的视网膜组织切片常规二甲苯脱蜡， 酒精梯度脫水， 0.01 mol/L 磷酸盐缓冲液（PBS）充分漂洗， 置入0.3%过氧化氢37℃孵育30 min， 去除内源性过氧化氢酶活性， 0.01 mol/L PBS漂洗5 min×3次后， 10%正常山羊血清中室温下孵育30 min， 滴加抗脑红素蛋白一抗（武汉博士德公司， 1∶50）， 4℃冰箱湿盒中过夜， 次日0.01 mol/L PBS漂洗 5 min×3次， 滴加1∶1000生物素化的羊抗兔二抗（武汉博士德公司）室温下30 min， PBS漂洗5 min×3次， 辣根酶标记链霉卵白素室温下孵育1 h， PBS漂洗5 min×3次， 3， 3'-二氨基联苯胺（DAB）显色3～5 min， 自来水冲洗， 贴片， 晾干， 脱水， 透明， 封片。阴性对照组：用羊血清替代一抗。

1. 2. 3 原位杂交 二甲苯脱蜡， 乙醇水化， 依次经100%、95%、80%、75%乙醇和焦碳酸二乙酯（DEPC-H2O）各1次， 5 min/次， 0.2 mol/L 盐酸溶液（HCL）室温处理5 min， PBS洗片3次， 蛋白酶K（40 μg/ml）室温下孵育20 min后， 含0.2%甘氨酸的PBS洗3次， 5 min/次， 4%多聚甲醛固定10 min后， PBS洗片2次， 醋酸干和三乙酸溶液室温下孵育10 min， PBS洗片2次， 50℃滴加预杂交液进行预杂交2 h， 50℃过夜杂交， 柠檬酸钠缓冲液（SSC）洗涤后， 洗膜缓冲液（TBST）洗5次后， 室温下封闭1 h， 滴加抗地高辛一抗（1∶1000）4℃孵育过夜。TBST洗4次， 碱性磷酸酯酶显色缓冲液（BCIP/NBT）染色液缓冲液洗2次， BCIP/NBT暗处染色24 h， TE缓冲液（pH 8.0）洗2次终止反应， 核固红复染5 min， 水洗残夜， 梯度酒精脱水， 透明封片。镜检， 拍照。

1. 2. 4 Western blotting RIPA裂解液裂解组织提取视网膜织总蛋组白， 二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量后， 取各组样本蛋白30 μg， 进行12%的聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）后， 电转至聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜）， 在5%脱脂奶粉的封闭液中封闭1 h， 加兔抗脑红蛋白单克隆抗体（1∶1000）， β-肌动蛋白（β-actin）（1∶1000）于一抗稀释液中， 4℃孵育过夜， TBST冲洗后， 与辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）室温下孵育2 h， 加化学发光剂曝光显影。

1. 3 统计学方法 采用SPSS12.0统计学软件对数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差（ x-±s）表示， 采用t检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2. 1 SD大鼠体重和血糖变化 诱导12周后， DR组大鼠体重为（309.0±11.0）kg， 明显轻于N组的（584.1±25.4）kg， 血糖为（30.1±5.4）mmol/L， 明显高于N组的（7.5±5.3）mmol/L， 差异均有统计学意义（P<0.05）。见图1。

2. 2 正常大鼠视网膜NGB的表达 免疫组化显示， 正常大鼠视网膜组织中光感受器层， 内、外丛状层和神经节细胞层可见脑红素蛋白表达。见图2。

2. 3 原位杂交 NGB mRNA原位杂交染色的阳性物质呈蓝色， 与N组相比较， DR组神经节细胞层、内核层、外核层、光感受器层可见强阳性表达， 主要为细胞质着色。见图3。

2. 4 糖尿病大鼠NGB的表达变化 Western blotting显示， DR组视网膜NGB表达增加为（132.46±15.83）， 较N组的（84.79± 16.78）明显增加， 差异有统计学意义（P<0.01）。见图4。

3 讨论

本研究发现， 在糖尿病大鼠视网膜组织中NGB表达增加， 原位杂交显示NGB在糖尿病大鼠视网膜神经节细胞层、内核层、外核层、光感受器层表达增加。

糖尿病视网膜病变是糖尿病主要的微血管病變， 也是糖尿病致盲的首要原因。其病理改变包括微血管的改变和视网膜神经细胞的改变。持续的高血糖环境使糖尿病视网膜病变患者微血管发生了异常组织氧合作用从而引起微血管功能改变， 周细胞的丢失、基底膜的增厚和内皮细胞的增生[4-8]。以上改变导致毛细血管完整性遭到破坏， 致使血管腔缩窄和血流改变， 促进糖尿病视网膜病变向后期发展， 发生毛细血管和小动脉闭塞， 导致视网膜的缺血、无灌注形成进而出现新生血管[9]。视网膜神经细胞的病变与微血管病变一样， 是糖尿病视网膜病变的重要组成部分， 它包括神经细胞的凋亡和神经胶质细胞的改变[10]。糖尿病视网膜病变的发展伴随着视网膜组织缺血缺氧。

NGB是新近发现的第三类携氧球蛋白， 其分子结构与血红蛋白和肌红蛋白具有同源性， 主要分布在脑、视网膜等神经组织， 在神经系统氧的摄取、运输和利用等生理过程中起着极其重要的作用， 体内各处NGB表达量的增加均与组织的缺血缺氧密切相关[11]。Sun等[12]研究表明， 体外培养神经元中， 低氧可诱导其NGB表达增高， 显著增强细胞抗缺氧的能力， 减少神经细胞的损伤;反义核酸封闭NGB的表达， 则导致细胞对缺氧损伤更为敏感。视网膜组织作为耗氧大的组织， 其NGB的表达远远高于脑组织。有研究表明， NGB除视网膜色素上皮和光感受器外节外， 在视网膜各层均有表 达[13]， 本研究也得到了相似的结果。本研究还发现， NGB在糖尿病大鼠视网膜神经节细胞层、内核层、外核层、光感受器层表达显著增加。Chan等[14]研究发现， NGB转基因鼠视网膜中， NGB过表达位于视网膜神经节细胞， 内外丛状层， 光感受器内节中， NGB转基因鼠视网膜NGB过表达可以减少因急性视网膜缺血引起的线粒体损伤， 从而抑制细胞凋亡。也有学者认为， NGB具有清除一氧化氮（NO）的功能， 参与NO的代谢过程， 从而减少NO对线粒体的损伤， 并且保护神经元及细胞来抵抗氧化应激[15]。

因此， 作者认为， 缺氧条件下诱导NGB表达增加， NGB可以通过为视网膜神经细胞提供氧， 保护线粒体功能， 减少细胞凋亡， 从而在糖尿病视网膜病变发展过程中起到神经保护作用。而NGB这种保护作用的机制有待进一步研究。

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[收稿日期：2019-01-15]