甘蔗内生菌B9的鉴定及其促生长机制和定殖能力的研究

狄义宁，刘鲁峰，胡一凡，谢林艳，李咏梅，何鹏杰，崔文艳，何鹏飞，李富生，3*，何丽莲，3*

（1.云南农业大学农学与生物技术学院 云南 昆明 650201；2.云南农业大学植物保护学院云南 昆明 650201；3.云南农业大学甘蔗研究所 云南 昆明 650201）

甘蔗是重要的糖料作物和能源作物［1］，其内部存在大量的内生菌。从1961年开始，中外研究者从甘蔗中分离出了大量内生菌。植物内生菌（endophyte）指能够在健康植物活组织中生存而不引起寄主植物明显病变的一大类微生物，是一类丰富的微生物资源，主要包括细菌、真菌和放线菌。现目前已从上百种植物中分离得到内生菌［2］，其主要寄生于植物细胞内、 细胞间隙［3-4］或木质部和韧皮部的维管束系统［5］。种类包括革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的71个属的 219 个种［6］，不同寄主植物与内生菌组成之间存在着差异，它们与植物长期互惠互利，共同生活，形成了独特的生态位。在植物为其提供一个更加安全稳定的生存环境下，细菌也利用着植物包括根系分泌物、裂解物等在内的营养物质进行生长繁殖，并且它们也合成分泌一些代谢产物从而影响植物生长。研究发现大部分从健康植物根组织中分离获得的内生细菌与植物根际促生细菌（plant growth promoting rhizobacteria，PGPR）相似［7］，具有促进植物生长作用［8］。其促进机制主要包括：（1）产生促植物生长物质，如植物生长素、赤霉素以及细胞分裂素等，直接促进植物生长；（2）活化养分作用，活化养分主要指如PGPR菌株能够提高土壤中的可利用养分量，即通过解磷、解钾、固氮及铁螯合等作用，为植物提供更多可利用的N、P、K及Fe等元素［9］；（3）改变根部周围的环境来缓解非生物压力，如分泌胞外多糖来改变土壤结构，从而增加植物根部对环境的适应性，促进植物的生长［10］。不仅如此，内生菌还会产生与病原菌竞争营养和空间（如铁载体［11-12］的产生），或直接产生拮抗物质，从而抑制病原菌，间接促进植物生长。研究也证明，内生菌定殖能力的强弱与数量直接影响着植株的生长，随着现代分子生物学水平的提高，绿色荧光蛋白（GFP）标记技术以其性能稳定，表达与受体细胞无关，方便检测等优点被许多研究者所采用［13］。内生菌具有深远的开发价值［14］，被誉为促进植物生长发育最大潜在微生物资源［15］。

1 材料与方法

1.1 菌株和质粒

供试菌株是本课题组从种植于云南农业大学甘蔗资源圃内的“云蔗99-91”根部组织中筛选得到的1株内生细菌，编号为B9（Genbank登录号：MH935511）；促生正对照专利菌株Y2（专利号：ZL200310104195.6）［16］与携带氨苄青霉素和氯霉素双重抗性标记的pHT01-P43GFPmut3a质粒由云南农业大学何月秋教授惠赠。

1.2 培养基与培养条件

试验所用培养基包括：①LB培养基；②Ashby无氮培养基［17］；③ Pikovskaya（简称 Pvk）培养基［18］；④NBRIP培养基［19］；⑤植酸钙培养基［20］；⑥优化解钾培养基（葡萄糖5 g，硫酸铵0.5 g，酵母粉0.5 g，硫酸镁0.3 g，磷酸氢二钠2 g，硫酸亚铁0.03 g，硫酸锰0.03 g，钾长石2 g，蒸馏水1 000 mL，pH值7.2）；⑦ Landy培养基［20］；⑧ LNM 培养基。B9，Y2菌株36 ℃培养；⑨MS培养基（常规配方）。

1.3 盆栽基质与供试作物

盆栽基质配方为草泥炭、珍珠岩、蛭石（2∶0.5∶1 v/v/v，每1 kg基质中混入0.4%磷矿粉与0.3%硝酸钾），121℃。0.1 MPa高温灭菌30 min备用。供试作物为玉米云禾单2号，盆栽甘蔗为ROC10号。组培苗为ROC22号无菌脱毒组培苗。

1.4 内生菌的鉴定

1.4.1 传统鉴定方法

将B9在LB平板培养48 h，观察其形态特征，并进行革兰氏染色；按照常见细菌系统鉴定手册方法，进行柠檬酸盐的利用、淀粉水解、硝酸盐还原、吲哚产生、明胶液化、硫化氢试验等生理生化指标测定。

1.4.2 现代基因片段测序

待测各菌株在LB液体培养基中培养至对数期，提取细菌的基因组DNA［21］，扩增16S rRNA、gyrB、rpoB片段后由公司完成测序。测序结果用DNAMAN软件拼接，在NCBI数据库中进行BLAST比对，选取同源性较高模式菌株的序列使用MEGA6软件构建系统发育树，Bootstrap重复值设置1 000，确定菌株的分类地位。

1.5 B9菌固氮能力初探与其溶磷解钾能力的测定

挑取活化后菌株单菌落，接种于Ashby，Pvk，NBRIP，植酸钙固体培养基上，置于37℃恒温培养箱中倒置培养。4 d后测量菌落直径（d）和透明圈直径（D），计算透明圈与菌落直径比（D/d），溶磷能力定量测定采用以无机磷源磷酸三钙［22］、有机磷源植酸钙为底物进行摇瓶培养，以不接菌摇瓶CK为对照，放于36℃，160 r/min恒温摇床培养，接种后1、3、5、7、9 d分别吸取发酵液测定发酵液pH值，并用钼蓝法［23］测定可溶性磷含量，细菌解钾能力的测定［24］采用火焰光度法检测上清液中的钾含量［23］。

1.6 吲哚-3-乙酸（IAA）的定量测定

IAA的定量测定参照文献［25］采用Salkowski比色法对IAA进行比色测定，IAA标准曲线采取IAA标准品制作。

1.7 嗜铁素的分类及其测定

采用CAS平板法，液体法进行嗜铁素活性测定，采用 FeCl3试验［26］、高氯酸铁试验［27］、Arnow 等试验［28］及 Shenker等试验［29］分析和确定菌株产生嗜铁素的类型以及嗜铁素相对含量。

1.8 细菌菌株对甘蔗幼苗、玉米种子的促生长作用

1.8.1 菌株活化备用

将供试菌株放于LB液体培养基37℃培养36 h，后将菌液经12 000 r/min离心收集沉淀，无菌水重悬，调节菌悬液浓度为106、107、108cfu/mL备用。

1.8.2 浸种发芽试验

选择饱满健康的玉米种子，75%酒精进行表面消毒，用上述3个梯度的菌液分别浸泡种子，无菌清水为空白对照，Y2菌液处理为正对照，每个处理30颗种子，重复3次，50 h后观测发芽情况，记录发芽势，种子胚芽与胚根长度。

1.8.3 盆栽试验

采用单芽苗催芽致鹦鹉嘴时期，移栽至基质中。处理为CK（清水）与B9菌液处理，控制菌含量为1×107cfu/g，灌根法浇施，每个处理6次重复，共12株苗。于出现性状差异后，测量株高、茎粗、鲜重、干重、叶绿素、根系活力及其植株氮磷钾［30］等农艺性状与理化性质。

1.9 B9菌株的自然转化及其稳定性测定

B9的自然转化具体操作见参考文献［31］，被标记的荧光工程菌株命名为B9-P43GFPmut3a。稳定性检测采用杨秀荣［32］方法进行。

1.10 B9菌在甘蔗幼苗内部定殖研究

选取已生根并长势基本一致的无菌脱毒ROC22甘蔗组培单苗，移装至含有20 mL的1/10MS液体培养液的玻璃试管中，培养基不含维生素，也未添加任何激素。周期为1、5、10、15、20、25、30、35、45、55 d，分别称取根茎叶0.1 g，消毒（75%酒精1 min，2%次氯酸钠2 min）并研磨涂板与含有10 μg/mL的氯霉素LB固体平板，以最后一次无菌水冲洗留下的冲洗液无菌生长的条件下，统计根茎叶，平板在光电折射仪下观察荧光菌数量，计算平均数。

2 结果与分析

2.1 菌落的特征、鉴定与系统发育进化树分析

B9菌在37℃在LB培养基上培养48 h，菌落特征见表1。生理生化鉴定结果B9符合芽孢杆菌特征，见表2。NCBI数据库比对结果中，B9菌在16S rRNA基因水平上与Bacillus subtilis strain CICC 10366同源一致性达到99%，gyrB基因水平上与Bacillus subtilis strain ATCC 21228达99%，rpoB与Bacillus subtilis strain ATCC 21228标准菌同源性达98%，在图1中，B9与Bacillus subtilis strain DSM 10T模式菌株归为同一分支，结合同源一致性大于98%则可判定统一菌种，B9菌最终鉴定为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。

表1 B9的菌落形态观察与生理生化测定

表2 细菌16S rRNA、gyrB、rpoB基因片段在NCBI数据库中比对结果

图1 最大似然法构建B9菌16S rRNA片段进化树

2.2 菌株固氮、溶磷、解钾能力测定

由表3可知，B9在Ashby培养基中正常生长，菌落颜色为黄白色，且有固氮圈的出现，可初步推断B9能产生固氮酶，依靠空气中的氮进行生长；除了在植酸钙培养基中没有发现明显的溶磷圈外，在Pvk、NBRIP平板上，均发现了溶磷圈。从图2液体培养基中可发现，对比不接菌空白对照，在Pvk（A），NBRIP（B）两个以 Ca3（PO4）2难溶性磷酸盐为底物的培养基中，接种B9菌，可溶性磷含量明显增加，B9菌在PVK、NBRIP培养基中7 d时可溶性磷含量最多，分别达（29.02±0.26）mg/L、（19.96±0.97）mg/L。在以植酸钙为底物的培养液（图2C）中，可溶性磷含量在9 d达到最大，溶磷量为（101.65±1.41）mg/L，可见，B9菌对不同磷源溶磷强弱分别为植酸钙＞磷酸三钙，具有一定的溶磷能力；在解钾培养基（图2D）中，7 d解钾量达最大值，为（5.455±0.135）mg/L。由图2A、B、C 3个图中还可看出，接种B9之后，培养基pH值低于空白CK，由此猜测其溶磷机制与产生有机酸有关。

表3 试验菌株在平板上的固氮与溶磷效果（5 d）

图2 B9菌在Pvk（A）、NBRIP（B）、植酸钙（C）、解钾液体培养基（D）中的溶磷解钾情况

由图3可见，在加入3 mmol/L色氨酸与不加两个培养基之间，IAA的产生量显著不同，B9菌在不含IAA的Landy液体培养基中培养，4 d时IAA含量最高，达到（1.914±0.11）μg/mL，在含有色氨酸为底物情况下，IAA在3 d时含量最多，为（63.067±2.49）μg/mL。在细胞数达到最大后，培养基中的IAA含量逐渐上升，随后下降。对于B9产生的嗜铁素初步推测为混合型（Mixed ligand）嗜铁素，因为同时具有异羟肟酸型、儿茶酚型及羧酸型嗜铁素的特征，含有两类或两类以上螯合基团的嗜铁素，LNM培养基中相对含量为26%。

2.3 菌液处理对玉米种子发芽情况及对甘蔗幼苗盆栽试验农艺性状与生理生化指标的影响

在菌液处理玉米种子50 h后，测量玉米的芽长和根长，B9和Y2处理均比清水对照生长更长，长势更好，芽长显著长于清水对照，根长更达到了极显著差异。B9催芽生根效果与空白清水对照和Y2处理相比，根长分别增加456.52%、93.94%，芽长分别增加100%、16.28%。结合表5数据得到B9的催芽生根最适浓度为106cfu/mL。同时B9处理提高玉米种子萌发率，与Y2相同，均比清水对照提高33.3%。

图3 B9在有无色氨酸的Landy培养基产生IAA与活菌数之间的关系

表4 B9菌产生嗜铁素的种类及相对含量

表5 菌液重悬液对玉米种子根芽组织促生效果

在B9处理对甘蔗幼苗灌根处理后，由图4与表6可见，处理组在叶绿素、根系活力指标中均高于清水，株高平均为（1.110±0.152）m，较清水空白对照增加13.1%，根长为（0.456±0.133）m，较清水增加62.85%，茎粗增加28.49%，在鲜重、干重方面，分别增加43.53%、34.03%，都与清水存在显著差异。在植株氮磷钾含量测定中（表7），B9处理组显著高于清水对照，茎部氮磷钾分别增加5.2%、0%、12.82%，叶部氮磷钾分别增加7.1%、1.8%、16.67%。

图4 盆栽试验中B9处理对甘蔗苗株生理生化指标的影响

表6 盆栽试验中B9处理对甘蔗苗株农艺性状的影响

表7 接种B9对甘蔗植株地上部分氮磷钾元素含量的影响 （g/kg）

2.4 荧光菌株的稳定性检测与植株内的定殖情况

试验结果（图5）显示，连续培养20 h后其遗传稳定性为97.39%，芽孢杆菌在实验室适宜条件下大约30 min能分裂一代，而其在自然条件下分裂一代所需时间在50～100 h之间［33］，因此认为构建的B9-P43GFPmut3a基因工程菌可以满足作物特定周期供研究的需要。为期55 d的跟踪检测结果（图6）表明，定殖于甘蔗根部的菌量最大，在接种1 d后就在根部检测到106～107cfu/g的荧光菌，后期稳定在105～107cfu/g含量之间，定殖与叶部及茎部的数量较根相比略少，随着培养时间的增长，数量呈现小幅上升，其中茎部稳定在103～105cfu/g，叶部稳定在103～104cfu/g，在激光共聚焦显微镜下观察可见绿色的菌体定殖在甘蔗根部，形成一层保护膜（图7e），由此可见，B9-P43GFPmut3a均能够在甘蔗根、茎、叶形成有效定殖。

图6 标记菌株B9-P43GFPmut3a在甘蔗体内的定殖的回收检测

图5 B9-P43GFPmut3a稳定性检测

图7 标记菌株B9-P43GFPmut3a在甘蔗体内的定殖情况

3 小结与讨论

试验的创新之处在于B9虽然分离于甘蔗品种云蔗99-91，但是在探究其促生长功能时，笔者加入了与甘蔗同科不同属的玉米作为试验对象，比较了内生菌在不同寄主的情况下的促生效应，扩大了B9内生菌的使用范围，同时对玉米粮食产业的增产增收也具有重大意义，试验后续将探究B9菌是否能对更多作物产生促生长效果，通过在不同作物上取得的效果，深化研究内生菌与植物的识别机制。

枯草芽孢杆菌于1872年被正式命名，其因为产生内生芽孢，耐热抗逆性强，在土壤和植物的表面普遍存在从而被广泛分离［34］，又因其不污染环境，对人畜无害，生长速度快，营养需求简单，易于存活、定殖与繁殖，无致病性，并可以分泌多种酶与抗生素，而且还具有良好的发酵基础，在工业、农业、食品、医药卫生、畜牧业和水产养殖及科学研究等领域中广泛应用。随着研究进一步深入，不少学者发现植物内部也存在枯草芽孢杆菌，但对其生物学功能研究的报道还与非内生枯草芽孢杆菌如FZB42等相比有一定差距。在测定B9菌生物学特性试验中，B9能在无氮源培养基中正常生长，并出现透明固氮圈，并在后期盆栽试验中，显著增加蔗苗的生物量与全氮含量，表明其具有固氮酶活性与固氮功能。本研究不足之处在于没有通过乙炔还原法对固氮酶活性进行定量测定，该内容与固氮酶基因nifH等的克隆与分类将在下一阶段研究中继续报道；溶磷能力方面，综合目前对筛选溶磷菌的报道，溶磷细菌溶磷能力一般多在19.2～519.7 mg/L范围内，多由土壤以及植物根际筛选分离，种类多为芽孢杆菌和假单胞菌。B9在以磷酸三钙为底物的磷源培养基中溶磷量为（29.02±0.26） mg/L，此数值与众多非芽孢阴性菌相比稍显逊色，但相比内生芽孢菌而言，如王辰月等［35］在线叶嵩草中分离的枯草芽孢杆菌LXA10，对无机磷的溶解能力为28.14 mg/L，B9溶磷能力略显优势，同时B9菌在以有机磷源植酸钙为底物时，表现出了较强的溶磷能力。B9菌针对不同磷源溶磷能力强弱依次为有机磷＞无机磷，对有机磷源的溶磷能力更强；B9菌解钾量为（5.455±0.135）mg/L，许多研究发现解钾菌在不同环境，不同菌种之间解钾量存在差异，相比于其他高效解钾菌的解钾效率，B9菌略低。但在盆栽回接试验中，通过测定甘蔗茎部及叶部的全氮、全磷、全钾含量，植株的叶绿素与根系活力，试验结果显示，B9处理的蔗苗在氮、磷、钾、叶绿素、根系活力水平上均高于清水对照，从植株理化性质证实了B9的固氮、溶磷、解钾能力。

对促生菌株IAA产生量的定量分析，嗜铁素的产生与种类，包括在植株内部的定殖情况计数分析，是目前对于研究促生机制的常用手段，但其意义也非常重要，试验结果B9菌在无色氨酸为底物的情况下IAA产生量为（1.914±0.11）μg/mL，在增加色氨酸后，IAA产生量大幅度提高，达到（63.067±2.49）μg/mL。B9产生铁载体类型为混合型铁载体，其因含有两类或两类以上螯合基团的嗜铁素，同时具有异羟肟酸型、儿茶酚型及羧酸型嗜铁素的特征［36］，该结果可以推断，在低铁的环境下，B9产生的铁载体对铁具有更强的结合作用。菌株B9能促进玉米种子萌发以及促进其胚芽，胚根长度发育初步推断是产生IAA等激素导致，当菌液浓度过高，产生IAA浓度偏大反而对种子发育产生抑制作用。在定殖前期，笔者也对转化成功的基因工程菌B9-P43GFPmut3a与野生菌株B9进行了玉米催芽与甘蔗组培苗促生长试验，二者并无差异，证明工程菌的促生长特性并未发生改变，其在甘蔗根、茎、叶内定殖检测结果真实可靠。菌株鉴定通过比对三大看家基因（16S rRNA，gyrB，rpoB）的检测，弥补了单纯使用16S rRNA基因片段的不足；在进化树构建方面采用了较邻接法更为准确的最大似然法，加上外观形态与生理生化指标，更加系统和全面。上述结果对丰富甘蔗有益内生菌种类和开发应用生物菌肥提供了理论依据和技术支撑，但田间验证试验和大田应用研究还有待下一步开展。