全波长扫描式多功能读数仪-硫酸肼还原比色法测定水中硝态氮含量

郭文淼，何烈汤，，张金尧，辛 宇，汪 洪*

［1.辽宁石油化工大学化学化工与环境学部，辽宁 抚顺 113001；2.中国农业科学院农业资源与农业区划研究所/国家化肥质量监督检验中心（北京）/农业农村部农产品质量安全肥料源性因子风险评估实验室（北京），北京 100081］

水中硝态氮的含量过高时，会对人体健康产生一定影响。进入人体的硝态氮可被还原成亚硝态氮，与血液中血红蛋白作用生成高铁血红蛋白，从而导致血液失去携氧能力，另外，还可与体内的二级胺类形成具有致癌、致突变危害的亚硝胺。硝态氮的含量高低是体现水体环境质量重要参数之一，目前我国对居民生活饮用水卫生标准（GB 5749-2006）硝态氮限值为10 mg/L，地下水源限制不得超过20 mg/L［1］。硝态氮的测定方法很多，主要包括麝香草酚分光光度法、紫外分光光度法、离子色谱法、镉柱还原法、戴氏合金还原法等［2-7］。麝香草酚分光光度法操作较繁琐，试剂配制过程复杂，所用化学试剂酸和氨水等对环境有影响。紫外分光光度法多用于硝酸盐含量高，有机物含量低的水样测定，但易受水中有机物的干扰。离子色谱法灵敏度高、稳定性好，但设备较昂贵。通过硫酸肼作为还原剂，将硝态氮还原为亚硝态氮，再利用对氨基苯磺酰胺及N-（1-萘基）乙二胺二盐酸盐（C10H7NH2CHCH2NH2·2HCl，简称NEDD）反应生成粉红色化合物，于540 nm处测得吸光度，可用于水中硝态氮含量的测定［8］。国家标准GB/T 7480-87《水质硝酸盐氮的测定酚二磺酸分光光度法》是目前水体中硝态氮的常用分析测定方法，该方法测量范围较大，显色稳定，是水质监测的推荐方法。但是该方法对反应条件要求严格，较难控制，易受水中含氯化物、亚硝态氮、铵盐、有机物和碳酸盐的干扰，造成测定结果准确度低。张英利等［9］利用连续流动分析仪结合硫酸肼还原比色法测定土壤硝态氮。

全波长扫描式多功能读数仪（酶标仪）采用多孔排列微孔板作为样品容器，由计算机控制设置特定波长，可快速读取微孔板内样品显色后吸光度，适用于大批量样品分析，操作简便。若采用96孔微孔板，每个孔板总体积为300 μL，试剂消耗明显减少。Ringuet等［10］采用了酶标仪测量水中硝态氮含量，其原理是采用混合酶作为还原剂，将水中硝态氮还原成亚硝态氮，再与磺胺发生重氮反应后与NEDD反应生成粉红色化合物于540 nm处测得吸光度。郭文淼等［11］建立了酶标仪-靛酚蓝测定水中铵态氮的方法，方法检出限为0.046 mg/L，测定重现性好，结果准确。本研究目的拟探讨利用酶标仪结合硫酸肼还原比色法测定水体中硝态氮，并与连续流动仪测定结果比较，旨在建立一个快速、准确、灵敏的测定水体硝态氮的方法。

1 实验部分

1.1 仪器设备

全波长扫描式多功能读数仪（酶标仪）（型号：Varioskan Flash，Thermo Scientific公司）、连续流动分析仪（型号：AutoAnalyzer 3，SEAL Analytical，ltd.公司）。

1.2 试剂

硫酸铜溶液：用称量纸称取0.1 g五水硫酸铜（CuSO4·5H2O）于100 mL烧杯，加入约50 mL去离子水，溶解后移至100 mL容量瓶中定容。

硫酸锌溶液：用称量纸称取1 g硫酸锌（ZnSO4·7H2O）于100 mL烧杯，加入约50 mL去离子水，溶解后移至100 mL容量瓶中定容。

氢氧化钠溶液：称量瓶称取1 g氢氧化钠（NaOH）溶入盛有约50 mL去离子水的塑料烧杯中，溶解后移至100 mL塑料容量瓶中定容。

硫酸肼溶液：用称量纸称取0.2 g硫酸肼加入约60 mL去离子水待完全溶解，再加入1 mL硫酸铜溶液，1 mL硫酸锌溶液定容至100 mL。

显色剂：先在50 mL去离子水中加入10 mL磷酸，加入1 g对氨基苯磺酰胺、0.05 g NEDD，溶解，定容至100 mL，储存于棕色瓶中。

硝态氮（NO3--N）标准储备液：称取7.218 g经105～110 ℃干燥2 h的优级纯硝酸钾，溶于去离子水，移至1 000 mL容量瓶中，加入2 mL三氯甲烷作保存剂，混匀，定容。硝态氮（NO3--N）标准使用液：取5.00 mL硝态氮标准储备液于100 mL容量瓶中定容。

实验所用试剂除标明外皆为分析纯。实验用水为三级去离子水。

1.3 实验步骤

选择96孔微孔板，利用移液器在每个孔板中加入60 μL待测水样，加入氢氧化钠溶液60 μL，加入还原剂硫酸肼溶液60 μL，盖住，在室温下放置30 min，然后加入显色剂，放置1 min，于400～600 nm波长范围内扫描，测定吸光度，确定最大吸收波长为545 nm。

6个水样显色0.5、1、2、3、4 h，在最大吸收波长（545 nm）处分别测定吸光度，发现在显色后2 h内反应体系吸光度无显著性变化，超过2 h吸光度有所下降，因此确定本测定体系的显色稳定时间为2 h。

用硝态氮标准储备液配制质量浓度ρ（NO3--N）为0、0.5、1、3、5、7、10 mg/L标准溶液系列，按照上述条件测定，将吸光度与NO3--N标准溶液质量浓度ρ（NO3--N）之间进行线性回归，标准工作曲线回归直线方程y=0.292 4x-0.065 3，相关系数R为0.997 1。

图1 酶标仪-硫酸肼还原比色法的标准工作曲线

1.4 连续流动分析仪测定步骤

连续流动分析仪测定水样中硝态氮原理是在碱性条件下，水样中NO3--N被硫酸肼还原成NO2

--N，然后与对氨基苯磺酰胺生成重氮盐，再与及N-（1-萘基）乙二胺二盐酸盐（NEDD）偶联生成粉红色的化合物，测定吸光值。流动分析仪设置进样速率60样/h，进样与清洗比为3.0∶1，进样时间45 s，清洗时间15 s。仪器默认设置基线和漂移校正，自动基线参比为4%；比色滤光片波长为550 nm，灯强度大于l 000 mV。

1.5 统计分析

每个水样品重复测定6次，6次测量值Xi的算术平均值为样品硝态氮含量的估计值，即测量结果。标准偏差用贝塞尔公式计算，即：

其中n=6，计算相对标准偏差。

采用Excel软件中分析工具库t-检验，进行成对双样本均值分析连续流动分析仪测定结果和酶标仪-硫酸肼还原比色法测定数据间差异显著性；两种方法测定数据之间进行相关分析，利用直线方程进行回归，统计分析相关系数的显著性。

2 结果与分析

2.1 酶标仪-硫酸肼还原比色法检出限

图2 酶标仪-硫酸肼还原比色法测定试剂空白硝态氮（-N）质量浓度

2.2 酶标仪-硫酸肼还原比色法测定精密度

在相同测量条件下，利用酶标仪-硫酸肼还原比色法对4个水样中硝态氮含量分别进行了6次重复测量，测定结果相对标准偏差均小于5.0%，在1.5%～4.4%范围内（表1），测定结果重复性较好。

表1 水样硝态氮（-N）质量浓度测定结果的重复性

表1 水样硝态氮（-N）质量浓度测定结果的重复性

水样编号相对标准偏差（%）1 7.78 7.62 8.09 8.05 7.85 7.97 7.89 2.2 2 2.63 2.53 2.66 2.69 2.49 2.66 2.61 3.1 3 0.71 0.65 0.68 0.67 0.72 0.65 0.68 4.4 4 4.47 4.60 4.50 4.48 4.39 4.48 4.49 1.5质量浓度ρ（NO3--N mg/L）平均值（mg/L）

2.3 酶标仪-硫酸肼还原比色法测定准确度—加标回收率

选择3个水样，根据每个样品的浓度分别加入高、中、低不同浓度-N标准溶液，按照同样实验步骤操作，进行加标回收实验，测定结果见表2。从表2中可见，样品加标回收率在88.0%～109.8%之间。

表2 样品中-N加标回收实验测定结果

表2 样品中-N加标回收实验测定结果

样品 原样质量浓度 添加质量浓度 测定质量浓度 回收率（%）ρ（NO3--N mg/L）水样1 7.72 3.00 5.18 88.0 7.00 7.71 109.8 10.00 9.08 104.3水样2 4.51 3.00 3.79 102.1 5.00 4.92 106.5 7.00 6.23 97.2水样3 1.99 1.00 1.45 90.7 3.00 2.45 101.0 5.00 3.52 97.4

2.4 与连续流动分析仪测定结果比较

图3列出了酶标仪-硫酸肼还原比色法和连续流动分析仪对29个水样中硝态氮（NO3--N）的测定结果，两种方法测定硝态氮质量浓度范围分别为0.90～9.30和0.94～4 10.33 mg/L，平均值分别为3.44和3.21 mg/L，t检验的双尾P值小于0.05（表3），两种方法测定结果彼此间无显著性差异。

图3 连续流动分析仪和酶标仪-硫酸肼还原比色法测定水样中硝态氮（-N）结果比较

表3 t检验-成对双样本均值比较分析酶标仪-硫酸肼还原比色法和连续流动分析仪测定结果

图4 连续流动分析仪与酶标仪-硫酸肼还原比色法测定水样中硝态氮（-N）结果相关性分析

3 结论

本文采用全波长扫描式多功能读数仪（酶标仪）结合硫酸肼还原比色法测定水中硝态氮（NO3--N）的含量，检出限为0.015 mg/L；方法的加标回收率在88.0%～109.8%之间；与连续流动分析仪法相比，两者测定数据之间呈良好的线性相关关系，回归直线方程为Y（连续流动分析仪）=1.153X（酶标仪-硫酸肼还原比色法）-0.255，相关系数R=0.987**（n=29，P＜0.01）；方法精密度较高，重复测定相对标准偏差小于5%。全波长扫描式多功能读数仪（酶标仪）结合硫酸肼还原比色法测定结果准确，重现性良好，可用于水样中硝态氮（NO3--N）含量的批量测定。