一株木质素降解菌的筛选鉴定及其在堆肥中的应用

2019-07-01刘悦秋蔡建超刘天月

中国土壤与肥料 2019年3期

尹静，刘悦秋，于峰，蔡建超，刘天月

（北京农学院园林学院，北京 102206）

木质纤维素是地球上分布最广，含量最丰富的可再生高能聚合物，每年再生的木质纤维素折合成能量相当于人类年消耗能量的20倍［1］。木质素主要存在于木材和秸秆中，是农林产业的主要副产物，每年全世界产量约1 500亿t，是储量巨大的潜在绿色资源［2］。然而，目前全世界对农林废弃物的利用率却很低，每年因农林废物焚烧、填埋等造成巨大的环境污染和资源浪费［3］。木质素是一类由5-羟基松柏醇、对香豆醇、芥子醇和松柏醇形成的酚类聚合物［4］，主要包围于管胞、导管和木纤维等纤维束细胞及厚壁细胞外［5］，由于它没有明确的结构，很难直接对其进行转化和利用，但可以通过降解将其转化为酚类化合物等低分子量的化合物，为资源转化和利用提供更多的可能［6］。木质素的结构比较复杂，在自然条件下降解速度缓慢，传统的物理、化学方法成本高，木质素的去除率低，还污染环境［7］，而生物降解法因专一性强、降解率高、环保，且成本较低等优点而被广泛应用［8］，成为农林废弃物开发利用研究的热点。

自然界中真菌是降解木质素的主要微生物，另外还包括一些细菌和病毒［9］。从自然界中筛选发现木质素降解微生物，成为近年来许多学者关注的重点。冯波等［10］从腐烂的木材中筛选到一株能够高效降解木质素的菌株，经ITS测序分析和形态观察，确定该菌为毛栓菌（Trametes hirsuta）。钱静亚等［11］通过固态发酵产酶研究发现，米曲霉能够产生木质素降解酶，且木质素过氧化物酶（LiP）和锰过氧化物酶（MnP）活性分别可达2.08、1.79 U/g。马英辉等［12］从造纸厂污泥中分离得到一株木质素降解放线菌灰略红链霉菌（Streptomyces griseorubens），该菌对木质素的降解率可达60%以上，其对木质素的降解主要依靠胞外漆酶（Lac）和胞外Lip。张鹏飞等［13］从园林废弃物高温期堆肥中，分离筛选出一株木质素降解力较强的细菌嗜热嗜脂肪地芽孢杆菌（Geobacillus stearothermophilus），Lac、Lip活力分别高达12.26、42.41 U/mL，且对木质素的降解率达到了20.1%。陈莹等［14］从园林废弃物高温好氧发酵堆体中筛选出一株降解木质素的链霉菌（Streptomyces sp.），将该菌接种到小叶榕的碎枝条上，测定结果表明，接种了该菌的枝条中木质素的质量分数降低了22.48%。本研究从森林土壤中筛选、分离、鉴定高木质素分解活性微生物，并将其应用于农林废弃物堆肥，探究其对堆肥效果的影响，以期发现新的对缩短堆肥发酵周期，提高发酵质量有显著作用的堆肥菌剂，为解决城市环境污染和自然资源浪费问题提供一种有效的解决办法。

1 材料与方法

1.1 试验材料

分离菌种的土壤样品采自鹫峰林下腐殖土。堆肥所需的枯枝落叶来源于北京农学院校园绿化废物，猪粪购自周边农村。

1.2 木质素降解菌株的筛选

将土壤样品按10-3～10-6的浓度梯度充分溶解于无菌水中，吸取混合液接种于PDA培养基上，并于28℃下培养5～7 d；根据菌落形态初步判定真菌、细菌和放线菌，然后接种于相应的培养基上，反复接种纯化直至获得纯菌株。将纯化后的菌株接种于PDA-愈创木酚培养基平板，28℃培养5 d，观察是否产生红棕色变色圈及变色圈的大小，筛选产漆酶（Lac）的菌株［15］；同样的，将纯化后的菌株接种于PDA-苯胺蓝培养基平板，28℃避光培养10 d，观察是否产生褪色圈及褪色圈的大小，筛选产锰过氧化物酶（MnP）和木质素过氧化物酶（LiP）的菌株［16］。

1.3 产木质素降解酶及酶活实验

用打孔器在菌落的边缘打直径5 mm孔，滴入数滴用96%乙醇配制的0.1 mol/L的α-萘酚（紫色显色圈-Lac），等量现配的4% H2O2与1%焦酚混合液（黄褐色显色圈-LiP、MnP），根据显色情况观察菌株是否产酶。将液体培养基置于35℃，150 r/min摇床中培养72 h后，取0.2 mL接种于100 mL产酶培养基中，在相同条件下培养48 h。每隔24 h取样测酶活，将培养好的液体产酶培养基先用纱布过滤，再将滤液于4℃，10 000 r/min离心15 min，取上清液即为粗制酶液。通过藜芦醇法，Mn2+法和ABTS法分别进行木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶、漆酶活性的测定［17］。

1.4 木质素降解能力的测定

将玉米秸秆粉碎过0.425 mm筛，分装于25个250 mL三角瓶，每瓶20 g，加入60 mL营养液［18］，高温灭菌3 h，接入YZC3菌种，质量分数为10%。然后适温培养（28℃），培养箱内相对湿度保持在80%，共培养25 d，5 d后开始取样，以后每5 d取一次样，每个处理取5瓶。每瓶取2 g待测样品置于100 mL锥形瓶中，加入50 mL 2 mol/L HCl，100℃保温50 min后用3号砂芯漏斗过滤，水洗残渣至pH值为6.5～7.0。将上一步得到的滤渣80℃烘干，连同砂芯漏斗置于150 mL烧杯中，加入10 mL 72%的H2SO4，降解4 h，加入90 mL蒸馏水，室温过夜，次日用蒸馏水水洗残渣至pH 6.5，烘干至恒重为W2，W2在550℃的马弗炉中灰化，得灰分W，木质素含量=W2-W1［19］。

木质素降解率=（原始玉米秸秆木质素含量-固态发酵后玉米秸秆木质素含量）/原始玉米秸秆木质素含量×100%。

1.5 菌株的鉴定

参照《真菌鉴定手册》对筛选所得的木质素降解菌YZC3进行形态特征观察和初步鉴定。分子生物学鉴定采用ITS rDNA测序分析。PCR扩增和序列测定：提取菌株总DNA为模板，采用真菌核糖体rDNA区通用引物ITS1（TCCGTAGGTGAACCTGCGG）和ITS4（TCCTCCGCTTATTGATATGC），扩增其ITS序列。PCR扩增体系参照文献［20］。测序结果在NCBI数据库中进行比对（BLAST），然后用MEGA 7.0软件进行系统发育树的构建。

1.6 堆肥实验

将收集的枯枝落叶与猪粪按1∶1混合，加入YZC3搅拌均匀，接种质量分数为1%，将不加菌的堆肥作为空白对照处理，每个处理进行3次重复。堆肥期间每天进行温度测定；堆肥结束时取样，将样品阴干粉碎后进行pH值、碳氮比（C/N）、种子发芽指数（GI）、电导率、全氮（TN）、全磷（TP）、全钾（TK）和腐植酸含量等指标的测定。测定方法根据中华人民共和国有机肥料农业行业标准NY525-2012。发芽指数（GI）选用白菜种子30℃下培养48 h测发芽率和根长，每个处理重复3次，GI=（浸提液中的种子发芽率×种子根长）/（蒸馏水中的种子发芽率×种子根长）×100%。

表1 堆肥材料理化性质

2 结果与分析

2.1 木质素降解菌的筛选

从鹫峰林下的腐殖土样品中分离出15种菌株，将15种菌株纯化后接种于PDA-愈创木酚和PDA-苯胺蓝培养基上进行培养，发现只有YZC3既能使PDA-愈创木酚平板显色（图1）也能使PDA-苯胺蓝平板脱色（图2）。

图1 YZC3愈创木酚显色反应

图2 YZC3苯胺蓝脱色反应

2.2 产酶及酶活测定

LiP、MnP产酶实验结果如图3所示，向平板内打孔处滴加等量4%与1%焦酚混合液后，出现黄褐色显色圈，说明YZC3能产生LiP和MnP。Lac产酶实验结果如图4所示，向平板内打孔处滴加0.1 mol/L用96%乙醇配制的α-萘酚溶液后，出现紫色显色圈，说明YZC3能产生Lac。

图3 YZC3产LiP、MnP酶实验

图4 YZC3产Lac酶实验

对YZC3进行木质素分解酶活力测定，如图5所示，在第8 d，YZC3产Lac出现酶活力峰值，为5.556 U/mL；YZC3产LiP和MnP能力较强，LiP在第7 d出现峰值，其酶活力为12.903 U/mL；MnP在10～12 d出现酶活力高峰，峰值为16.4 U/mL，显示出YZC3具有较强的木质素降解能力。

图5 酶活力随时间变化

由图6的数据可知，YZC3对木质素的降解率随着固态发酵培养时间的延长而增加，25 d时对木质素的降解率达到了最大值（79.2%）。司梦莹等［21］从某制浆造纸厂的废水污泥中筛选出2株高效木质素降解菌，分别为鞘氨醇杆菌（Sphingobacterium）LD-1和芽孢杆菌属（Bacillus）的菌株LD-2，其木质素降解能力最高分别达到52.23%和50.36%。钱静亚等［11］用3种木质素降解菌发酵玉米芯粉，发现黄孢原毛平革菌木质素降解率最高，为11.7%。对比可见，YZC3是一种高效木质素降解菌。

图6 YZC3木质素降解率随时间变化

2.3 菌种鉴定结果

2.3.1 YZC3的形态特征

由图7和图8可知，YZC3在PDA培养基上生长良好，菌落直径40～43 mm，絮状，白色，中部略带浅黄色；背面浅黄色，色素不渗入培养基。菌丝直径约为8～12 μm；分生孢子梗高大，长200 μm，宽3.0～5.0 μm，帚状或轮状分枝，产孢细胞呈烧瓶形（帚状分枝）或披针形（轮状分枝），（9.0～38.5）×（1.5～2.5）μm，顶端宽不足1 μm；分生孢子椭圆形、肾形，无色，壁光滑，（3.3～6.7）×（2.0～3.2）μm，聚集成团。

图7 YZC3菌落形态

图8 YZC3扫描电镜图

2.3.2 YZC3的ITS序列片段分析

将PCR扩增获得的ITS序列在NCBI上进行BLAST，使用软件MEGA 7.0将YZC3与11株菌进行Neighbor-Joining系统发育树的构建。如图9所示，YZC3与登录号为HQ607798的粉红粘帚霉同源性最高，亲缘关系最近。通过形态学特征及分子生物学鉴定，确定YZC3为粉红粘帚霉（Clonostachys rosea）。

图9 基于ITS序列构建的Neighbor-Joining系统发育树

2.4 YZC3对枯枝落叶堆肥的影响

2.4.1 YZC3对堆肥腐熟的影响

腐熟度是堆肥中的有机物经过矿化、腐殖化后达到稳定化的程度，是衡量堆肥产品质量好坏的一个综合指标，可以根据堆肥的温度、C/N、电导率、pH值和GI来判断。我国《粪便无害化卫生标准》（GB7959-87）规定，堆肥温度在50℃以上并持续5～7 d，便符合粪便无害化标准。如图10所示，加菌堆肥初期温度快速升至最高，持续11 d后下降至50℃以下，经过较长的后熟期后，温度回归到环境温度，比CK处理高温持续天数多6 d；YZC3处理二次发酵天数也比CK多3 d（表2），说明YZC3有利于延长堆肥高温期，提高堆体温度，有效杀死堆肥中的病原微生物。刘月等［22］研究表明高温期和二次发酵期是木质素快速降解的时期，较长的高温期有利于木质素的充分降解，也说明YZC3有利于堆肥中木质素的降解。C/N是判断堆料腐熟程度的重要指标，堆肥过程中C/N不断下降，理论上应趋于微生物菌体的C/N即16左右［23］，但对一些原料来讲，其本身的C/N过高或过低，所以C/N降到16左右难以作为广义的指标参数使用。Morel等［24］建议采用T=（终点C/N）/（初始C/N）来评价腐熟度，认为当T值小于0.6时堆肥达到腐熟。如表2所示，YZC3处理T值显著低于对照且低于0.6，说明其有助于堆肥的腐熟。电导率和GI也是判断堆肥腐熟程度的指标。电导率是以数字表示的溶液传导电流的能力，离子浓度越高，导电能力越强；离子浓度高则表明堆肥中有机质分解的多，堆肥腐熟程度越高。如表2所示，YZC3处理的电导率显著高于空白处理，同样说明YZC3有利于堆肥材料分解和堆肥腐熟。未腐熟堆肥含有高浓度的低分子量有机酸、多酚等植物生长抑制物质，这些物质随着堆肥进程逐渐被降解转化［25］。GI不仅可以体现堆肥的植物毒性，还能够判断堆肥的腐熟程度，通常认为，当GI大于80%，堆肥已无植物毒性或者说堆肥已腐熟［26］。由表2可知，各处理的发芽指数虽无显著差异，但YZC3处理GI大于80%，而CK处理接近80%，也说明YZC3有助于加速堆肥腐熟。

图10 堆肥温度变化曲线

表2 堆肥腐熟程度指标

2.4.2 YZC3对堆肥品质的影响

堆肥中TN、TP、TK以及腐殖质的含量是评价肥料的重要指标，全效养分含量越高，堆肥品质越好。如表3所示，加入YZC3的堆肥中TN含量显著高于空白对照，说明该菌有助于减少堆肥过程中氮素的损失；而各处理中TP、TK的含量并无显著差异，说明YZC3对TP、TK含量的影响不大。

表3 堆肥养分指标（mg/g）

在堆肥过程中，原料中的有机质在降解的同时还进行着腐殖化过程。腐殖质含有大量的官能团（如羧基、酚羟基等），能够吸附和固定重金属离子，而腐殖质在土壤中通常以游离的腐植酸和腐植酸盐类状态存在。Lopez等［27］评价了真菌作用下木质素生物降解与腐殖质产生的相关关系，结果表明真菌显著降解木质素，加强了聚合产物的生成，促进土壤腐殖质产生。郁红艳［28］的研究也表明，接种木质素降解菌能促进发酵体系中腐殖质的形成，不仅表现在使发酵体系中腐殖质含量更高，且能够明显缩短腐殖质形成时间。本实验如表3所示，YZC3处理的堆肥中腐植酸含量显著高于空白对照，说明YZC3能够加速木质素降解，形成腐植酸，有助于堆肥的腐殖化过程，与上述研究结果一致。

3 讨论

微生物有3类酶系与木质素的降解有关，H2O2产生酶系（乙二醛氧化酶、葡萄糖氧化酶等）、木质素氧化酶系（木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶、漆酶等）、其他酶系（纤维二糖脱氢酶、甲基化酶等）［29］。研究最多并被公认为最重要的3类木质素降解酶是木质素过氧化物酶（LiP）、锰过氧化物酶（MnP）和漆酶（Lac），这3种酶在木质素降解过程中的作用主要是攻击木质素聚合物结构，将其解聚成更小的分子或者单体的苯环物质［30］，是木质素降解的关键酶。MnP能通过降解反应氧化木质素中约占10%的抗性更强的酚结构，它以H2O2为氧化剂，氧化Mn2+生成Mn3+，Mn3+能够穿透木材，氧化酚型有机物［31］。LiP是一系列含Fe3+、卟啉环和血红素辅基的同工酶，可以利用H2O2及有机过氧化物催化一系列底物，其催化具有非特异性［32］。Lac是一种含有4个铜离子的多酚氧化酶［33］，它的氧化底物极为广泛，包括酚类及其衍生物、芳胺及其衍生物、芳香羧酸及其衍生物等［34］。本项研究筛选到的粉红粘帚霉YZC3菌株具有高效的木质素降解能力，木质素的降解率达到了79.2%，可以同时产LiP、MnP和Lac 3种重要的木质素酶，且MnP酶活性较高，为16.4 U/mL，这也表明粉红粘帚霉YZC3菌株不仅可以降解固体废物中的木质纤维素，同时它还可以处理芳香有机物等污染物，特别是苯酚类物质。苯酚广泛应用于石油炼制、石油化工、制药和树脂制造等行业，因此也是这些行业废水中的主要污染物［35］，粉红粘帚霉YZC3菌株因其具有较高的MnP酶活性，在处理苯酚污染方面具有潜力。

粉红粘帚霉除了能够降解园林废弃物，还是一种生物防治剂，可以抑制多种植物病原菌的孢子形成并杀死病原线虫［36-37］和蚜虫［38］，它不仅对病原菌具有重寄生、竞争、抗性和溶菌等作用，还能诱导植物产生系统抗性［39］。李丹阳等［40］研究发现，粉红粘帚霉可从源头上遏制稻曲病的发生；王淑芳等［41］研究发现粉红粘帚霉对水稻纹枯病的防治效果十分显著；王瑞虎［42］研究发现，粉红粘帚霉能在番茄果实接种灰葡萄孢菌后诱导植物产生非寄主抗性；李叔强等［43］发现粉红粘帚霉对黄瓜枯萎病具有一定的防治作用；高航［44］研究发现红粘帚霉对杨树溃疡病菌（Botryosphaeria dothidea），腐烂病菌（Valsa mali），杨树腐烂病菌（Valsa sordida），尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）的抑制率均达到60%以上；Sun等［45］通过转录组测序发现，粉红粘帚霉具有16个与厚垣孢子形成相关的基因，对其生物防治的分子机制有了初步的探索和了解。综上所述，YZC3具有极高的开发利用价值，它不仅能够防治多种植物病原菌，杀死病原线虫和蚜虫，还可以降解园林废弃物，在解决园林废弃物污染问题的同时，可生产生物质抗病虫菌肥，是一种宝贵的微生物资源。