山东长清栝楼及丹参根结线虫病原虫种类研究

韩坤鹏，刘杨，万鹏

(山东中医药大学， 山东 济南 250355)

栝楼，其果实称为瓜蒌，根部称为栝楼，功能主治肺热咳嗽、胸痹心痛等症状[1-2]。在政府和农技部门的十力支持下,长清区这几年大力发展栝楼产业,让栝楼形成了种植、生产、加工、销售一条龙的区域特色产业，然而根结线虫病是栝楼重要病害之一，其危害也日趋严重，影响瓜农的经济效益，对栝楼根结线虫病的研究有着迫切的需要。

丹参又名赤参，为草本植物，是根部入药的重点药材，有活血调经，养血安神之功效[3]。长清区种植丹参有300余年的历史，具有适宜药材生长的自然条件，历经多年研究，也培育出了优质丹参。然而根部的病虫害仍然是困扰丹参种植的主要问题。因此，对丹参根部病虫害的研究具有重要的意义。

近年来，寄生线虫尤其是根结线虫对中药材的危害，在很大程度上影响了药材的产量和质量。而关于影响药材生长的根结线虫病的研究较少，特别是对药材栝楼和丹参根结线虫病的病原虫研究最近几年未有新的进展[4-7]，病原也并不明确。为确定长清马山镇中药材线虫病的主要病原，明确其危害，本实验提取发病植株体内的线虫，进行显微观察，根据线虫的外观特征初步鉴定病原线虫，以期为该地区根结线虫病的防治起到积极的作用。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 取样范围

实验所需药材于2017年5月上旬采自济南市长清区马山，5月中旬采自济南市长清区山东中医药大学苗圃。

1.1.2 取样方法

在固定点选取病株，在其植株附近，用铁锨除去地表其他杂草等物后，挖取10～15 cm土层的根系。

1.1.3 重复取样

采集丹参标本6份，采集栝楼标本4份，将采集到的植株病根放到事先准备好的封口袋中，在标签上注明时间和地点。

1.1.4 样本处理

样本要立即处理，或冰箱中冷藏(5～10 ℃)。

1.2 实验方法

1.2.1 线虫的分离方法

在苗圃将药材根取回实验室，用清水轻轻冲干净病根上的泥土，然后将病根切成0.5 cm左右的细根块，采用贝曼漏斗法(Baermann funnel)将线虫与根分离。选用直径10～14 cm的漏斗，剪取一小段橡胶管接在下方，乳胶管上加一个止水夹后置于漏斗架。在漏斗中装入无菌清水，将切碎的根块用两层韧性好的卫生纸包好，放入清水中，水量没过根块即可。待24 h之后，将橡胶管上的止水夹打开，收集漏斗底部大概5 cm处液体[8]。

1.2.2 TAF固定液配制

7 mL 体积分数40%的甲醛与2 mL三乙醇胺加45.5 mL水[9]。

1.2.3 临时装片制作与观察

选一次性滴管吸少量含有线虫的溶液，滴一滴在载玻片上，盖上载玻片，不要产生气泡，然后用滤纸吸取多余液体，防止污染物镜。在显微镜下观察线虫特征。

1.2.4 线虫的灭活与固定

试管取3 mL线虫溶液，将水浴锅加热到65 ℃，试管用试管夹夹住，在水浴锅内加热2～ 3 min，直到线虫死亡，立即加入3 mLTAF固定液(等量即可)[10-11]。

2 结果与分析

2.1 根结线虫病症状描述

感染根结线虫病的病根上有类圆形根结，单个或成串，成念珠状，症状明显。其主要危害在于根部瘤状突起、腐烂、生长不良、沤根，同时也会使植株枯枝枯叶、黄化，扭曲萎蔫、植株矮小、生长缓慢。生病根上生长着很少的须根，老根也会反复侵染线虫，长成形态较大的不规则类圆形凸起。开始为白色，10～12 d后会呈黑色，易腐烂，脱落，木质部露出[12-13]。待线虫长到一定大小可以在解剖镜下直接解剖提取线虫，线虫形态小，身体透明，需得借助光学显微镜等仪器观察[14]。

2.2 病原种类鉴定

2.2.1 丹参植物根中根结线虫主要类型

2.2.1.1 南方根结线虫(Meloidogyneincognita)

新幼虫特征：唇部平坦；有球形中食道，瓣门突出；尾部无色透明，身体末端有明显特征，尾部有小部分皱缩。幼虫尾尖尖圆。如图1所示。

A线虫尾部(×400) ；B线虫头部(×400)；C线虫整体观(×200)图1 南方根结线虫光学显微镜下形态Fig.1 Morphology of Meloidogyne incognita under optical microscope

2.2.1.2 纤毛棘刺线虫(Helicotylenchusapiculus)

雄虫：线虫经温热杀死后呈直线形或稍稍向内弯曲，雄虫比雌虫略长，体形更加纤细。雄虫口针较不发达，食道部分退化。交合伞长包至尾端后。如图2所示。

实验材料中未见雌虫。

A线虫头部(×400) ；B线虫中部(×400)；C线虫尾部(×400)图2 纤毛棘刺线虫光学显微镜下形态Fig.2 Morphology of Helicotylenchus apiculus underoptical microscope

2.2.1.3 咖啡短体线虫 (Pratylenchuscoffeae)

雌虫：体形粗短，经温热杀死后虫体变僵直或略弯曲。皮纹明显，有4条侧线，侧带非网状。唇区低且稍皱缩，2 条平唇环 。头架轻度骨化，向虫体后延伸一个体环的距离。口针粗短且发达，基部球呈圆形。背食道腺在口针基部球。有类圆形中食道球。有前伸单卵巢。尾部呈类圆柱形，尾端无纹，多数平截，少部分线虫尾部有一个明显的凹痕。

雄虫：雌、雄虫数目特征基本一致。雄虫的前体较窄，口针基部球宽度上退化明显。雄虫的交合刺成对存在，纤细，约 17 μm。如图3所示。

A线虫头部(×400)； B线虫尾部(×400)；C线虫整体观(×200)图3 咖啡短体线虫光学显微镜下形态Fig.3 Morphology of Pratylenchus coffeae under optical microscope

2.2.1.4 穿刺短体线虫 (Pratylenchuspenetrans)

雌虫：线虫水浴加热杀死后虫体僵直或稍稍向腹部弯曲，体纹纤细;唇区较高，无皱缩，唇环3 ，前部平坦。头架较发达，外缘向后延伸与第 1 条体环相连。口针发达且粗短，有较宽的基部球。基部球在背食道腺前方 。雌虫中食道球近圆形，清晰易观察，瓣膜明显，宽度约等于该处体的半径。单卵巢，有较大的圆形受精囊，约等于3/4体宽的 ，可见其充满精子。阴道长约体宽的 1/4，较直。尾部体环明显，尾的中上部有侧尾腺口。虫尾呈锥形或锥圆形，末端钝圆无纹。 如图4所示。

样本中未见雄虫。

A线虫整体观(×200)； B线虫头部(×400)； C线虫尾部(×400)图4 穿刺短体线虫光学显微镜下形态Fig.4 Morphology of Pratylenchus penetrans under the optical microscope

2.2.1.5 美洲剑线虫(Xiphinemaamericanum)

雄虫：有高唇区，呈球形，骨化不明显。唇环有3到5 个，缢缩，侧唇、食道、口针皆退化，中食道球和瓣膜不明显，针状口针，无基部球。单精巢。复合刺强壮，末端尖。交合伞至尾长 2/3 处，雄虫末端纯圆或尖。如图5所示。样本中未见雌虫。

A线虫头部(×400)； B线虫尾部(×400)； C线虫整体观(×200)图5 美洲剑线虫光学显微镜下形态Fig. 5 Morphology of Xiphinema americanum under the optical microscope

2.2.2 栝楼中主要线虫类型

2.2.2.1 假强壮螺旋线虫 (Helicotylenchuspseudorobustus)

虫体经水浴加热杀死后，大部分线虫体前端较直而尾端弯成环形，有少部分弯曲较大呈 “C” 形。虫体侧区 4 条侧线，体前端网格化。半圆形唇区，与虫体相连无间隔，有若干个不太明显的环纹。口针发达，基部球明显，前部平坦或稍稍凹起。有卵圆形的中食道球，位于排泄孔后方。受精囊呈卵形。线虫尾部有明显的腹突和细纹。侧尾腺开口先于肛门，呈小孔状。如图6所示。

A线虫尾部(×400)； B线虫头部(×400)；C线虫整体观(×400)图6 假强壮螺旋线虫光学显微镜下形态Fig 6 Morphology of Helicotylenchus pseudorobustus under the optical microscope

2.2.2.2 美洲剑线虫 (Xiphinemaamericanum)

雌虫：虫体中部圆柱形，头部和尾部较之细，水浴65 ℃加热杀死后，虫体呈“C”形或“J”形。表皮环纹很细。唇区前端平坦，中部稍稍凹起，头部缢缩。齿针长 128～143 μm，齿针延伸部分的基部膨大。食道与肠分界清晰。对伸双卵巢。阴门长约体宽的1/4，位于体长2/1处。尾圆锥形，背面略拱起，尾长于肛门处体宽， 有尾乳突约4个。 幼虫水浴加热杀死后呈“C”形。如图7所示。

图7 美洲剑线虫光学显微镜下形态(×200)Fig. 7 Morphology of Xiphinema americanum under the optical microscope

3 讨论与结论

瓜蒌和丹参是我省重要的道地药材，随着种植年限的延长和连作面积的增加，丹参和栝楼根部病害发生逐年加重，给这两种植物的生产安全带来严重威胁。但目前对根结线虫病害的研究还远远不够。

本文根据对长清地区6份丹参样本、4份栝楼样本共 10份样本的分离鉴定，共鉴定出以下6种线虫：咖啡短体线虫(Pratylenchuscoffeae)、南方根结线虫(Meloidogyneincognita)、纤毛棘刺吸虫(Helicotylenchusapiculus)、美洲剑线虫(Xiphinemaamericanum)、穿刺短体线虫(Pratylenchuspenetrans)、假强壮螺旋线虫(Helicotylenchuspseudorobustus)。根据以上结果，说明感染植物根结线虫病的药材根中并非只有一种线虫，即药材根结线虫病发生时可能被多种线虫感染。实验中所取的感染根结线虫病的丹参病根中以咖啡短体线虫数量最多，其次是美洲剑线虫。

本研究结果表明，一些植物根寄生线虫虽然寄主多样，但不同植物的根结线虫有很大差异，对于每种的线虫具体防治方法需要更深一步地探讨。因此，在丹参与栝楼的种植过程中，为防治根结线虫的危害，应尽量选用无病种苗、合理施肥、科学轮作、倒茬和宽、窄行高垄栽培等农业措施为主，移栽前穴施毒土、药液浸根和生长期药剂灌根相结合的综合防治措施，这样能够更加高效且绿色环保地促进丹参和栝楼的种植和产量。