CJ016对H1975细胞周期和细胞凋亡的影响

万 丹，甘 萍，谭永红

小分子抗肿瘤化合物因其结构简单，代谢途径和作用机理便于研究分析，同时合成途径相对简捷，以及经济、低毒等特点而备受关注。在基因突变或缺失导致癌症发生的进程中，组蛋白去乙酰化酶（HDACs）能通过反向调节染色质修饰来影响基因表达，诱发癌症发生、发展，目前已成为治疗癌症的一个潜在靶点[1-3]。近年来，已发现几类抗癌活性较好且特异性强的HDACs抑制剂，有些已进入临床治疗。但是，这HDACs抑制剂多被用于血液瘤等疾病的治疗，在面对肺癌、肝癌这些多见实体瘤时，疗效却不尽如人意。为了能改善HDACs抑制剂治疗实体瘤的疗效，本课题组自主合成了小分子化合物CJ016（图1），同时选择吉非替尼耐药的H1975细胞作为研究对象，观察CJ016对H1975细胞周期和细胞凋亡的影响，从而分析其抗肿瘤作用机制，为进一步研究提供理论基础[4]。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株 人非小细胞肺癌细胞株（NCIH1975）购自中科院上海生命科学院细胞资源中心。

图1 CJ016分子结构式

1.1.2 试剂与设备 化合物CJ016由本课题组自主合成、纯化；紫杉醇（Paclitaxel，PTX）购自大连美仑生物技术有限公司；碘化丙啶（PI）、Annexin V购自美国Sigma公司；MTT购自美国Sigma公司，规格1 g/瓶；RPMI-1640培养基购自美国HyClone公司；优级胎牛血清购自草原绿野生物工程材料有限公司；M5型全波长酶标仪购自美国Molecular公司，FASC420型流式细胞仪购自美国Thremo公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 H1975细胞培养于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中，细胞复苏后，每48 h传代一次，镜下观察细胞生长形态和密度，在5%CO2和37℃的恒温培养箱内培养，连续传代培养3次，选择生长相对稳定的对数期细胞用于后续研究。

1.2.2 CJ016对H1975细胞增殖的影响 取对数生长期细胞，按4×104个细胞/ml接种于96孔板，100 μl/孔。培养24 h后，分别加入终浓度分别为2.5、5、10、20、40、80 nmol/L 的 CJ016，空白对照组加等体积的培养基，每组6个复孔。继续培养24、48、72 h后，用MTT法检测细胞生长情况并计算细胞抑制率（%）。抑制率（%）=（空白对照组OD值-给药组OD值）/空白对照组OD值×100%。

1.2.3 PI染色测定细胞周期 用0.25%胰酶消化并收集H1975细胞，按4.5×105个细胞/孔的密度接种于6孔培养板中，培养24 h后，加入终浓度分别为 10、20 nmol/L的 CJ016和 20 nmol/L的 PTX，作用24 h后消化并收集细胞，用2 ml PBS洗2次，1000 r/min离心3 min，用预冷的70%乙醇4℃固定过夜。离心，用 Buffer缓冲液 （Rnase A 1 μg/L，EDTA 20 mM/L）重悬后，于室温孵育30 min。加PI染液 0.4 ml（1 mg/L），小心混匀，避光室温染色 1.5 h，用流式细胞仪检测DNA含量[5-7]。

1.2.4 Annexin V/PI双染色检测细胞凋亡 用0.25%胰酶消化并收集H1975细胞，按4.5×105个细胞/孔的密度接种于6孔培养板中，正常培养24 h后，将培养细胞分为4组：CJ016给药组（加入终浓度分别为10、20 nmol/L的CJ016）、PTX组 （加入终浓度为20 nmol/L的PTX）、空白对照组（加入等体积的培养基）。继续培养48 h，消化并收集细胞，用细胞筛过滤。血球计数板计数后，每组收集≥2×105个细胞。用0.3 ml Buffer缓冲液重悬细胞于流式管内，加5 μl的Annexin V-FITC，室温避光染色30 min。加10 μl的PI染液，室温避光染色10 min，用流式细胞仪检测细胞凋亡情况[8-9]。

1.3 统计学方法 应用SPSS19.0统计软件分析数据，实验数据以±s表示，采用方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CJ016对H1975细胞增殖的影响 随CJ016给药浓度不断增加，细胞抑制率也相应提高，在80 nmol/L的剂量时，已基本没有细胞存活。同时，随CJ016给药时间不断延长，细胞抑制率也随之增加，72 h时对细胞的抑制活性最大。见图2。

2.2 CJ016对H1975细胞周期的影响 与空白对照组比较 （18.27%），CJ016处理H1975细胞24 h后，能将细胞阻滞在合成期和分裂期（G2/M），10、20 nmol/L的CJ016使G2/M细胞比例明显增加，分别为25.15%和42.11%。同时，S期细胞比例有所增加，G0/G1期细胞比例相对减少，且呈现出一定的剂量差异。见图3。

图2 CJ016对H1975细胞增殖的影响

图3 CJ016对H1975细胞周期的影响

2.3 CJ016诱导H1975细胞凋亡 空白对照组发生凋亡的细胞比例很少，凋亡细胞总数＜1%；阳性对照紫杉醇组凋亡细胞总数为20.29%。CJ016处理H1975细胞48 h后，细胞凋亡比例明显增加：与空白对照组比较，10 nmol/L的CJ016使细胞早期凋亡（7.52%）和晚期凋亡 （10.1%）的比例明显增加；20 nmol/L的CJ016使细胞晚期凋亡（25.8%）的比例明显增加，且呈现一定的剂量差异。)+见图见图 4。

3 讨论

图4 CJ016对H1975细胞凋亡的影响

HDACs是参与人体内染色体重塑的一类重要激酶，其在表观遗传和基因表达中起关键作用，与癌症的发生发展密切相关。小分子化合物因其结构相对简单，合成途径较简捷经济，从而广受关注。因此，利用小分子化合物来治疗癌症的方法在临床上被广泛使用。CJ016作为小分子HDACs抑制剂，在体外能有效抑制H1975细胞增殖，本课题组观察到，当CJ016给药浓度高于20 nmol/L时，镜下观察可见细胞数量明显减少，细胞皱缩变圆，半贴壁或漂浮死亡。且随给药浓度不断增加，抑制作用也随之增强，呈现出较广的治疗窗口。同时，随着作用时间的延长，其对肿瘤细胞的抑制效果也相应增加。流式检测结果发现，10 nmol/L的CJ016处理H1975细胞48 h后，凋亡细胞比例（17.62%）较空白对照组（0.732%）明显增多，凋亡细胞大多处在晚期凋亡中；而20 nmol/L的CJ016诱导细胞凋亡比例 （26.92%）高于10 nmol/L组，存在一定的剂量效应关系，且略优于阳性对照紫杉醇组（20.29%）。表明CJ016能有效诱导H1975细胞发生凋亡，从而抑制肿瘤细胞恶性增殖。从图3也可以看出，CJ016处理H1975细胞24 h后，能剂量依赖地将细胞周期阻滞在G2/M期中，一定程度地减缓细胞正常有丝分裂，起到抑制细胞增殖的作用。

综上所述，CJ016能有效地阻滞H1975细胞分裂增殖，诱导细胞发生凋亡，起到延缓或抑制肿瘤细胞恶性传代的作用，具有一定的抗肿瘤作用。