深度测序解析年龄及UCMSC治疗对猕猴lncRNA的影响

朱向情，陈裕浩，王严影，高 萌，潘兴华

长链非编码RNA（lncRNA）是一类长度＞200个核苷酸的非编码RNA，其转录水平和状态与细胞分化、个体发育及人类疾病等相关。lncRNA的表达具有严格的细胞类型和组织特异性，还具有精确的时间和空间表达模式，在恶性肿瘤、退行性疾病等疾病中可出现序列、空间结构、表达水平、与结合蛋白相互作用的异常[1]。为探讨年龄和脐带间充质干细胞（UCMSC）治疗对外周血单个核细胞lncRNA的影响，本研究对不同年龄猕猴及UCMSC治疗后的老年猕猴外周血单个核细胞的全转录组进行测序分析，试图解析年龄和UCMSC对lncRNA表达的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 不同年龄健康猕猴12只，分为幼年、中年、老年和老年UCMSC治疗4个组，每组3只，均为雄性。其中幼年组为年龄1岁，、体重 2～3 kg；中年组为年龄 10 岁，体重 8～10 kg；老年和老年UCMSC治疗组为年龄22～24岁，体重8～10 kg。编号分别为老年组1～3号，中年组4～6号，幼年组7～9号，老年UCMSC治疗组10～12号。实验用猕猴均来自于中国科学院昆明动物研究所实验动物中心，在医院实验动物中心进行饲养和实验，动物使用经过医院实验动物伦理委员会审查、批准。

1.2 UCMSC来源及治疗 猕猴UCMSC来源于剖腹产母猴的脐带组织，UCMSC的制备和鉴定在本实验室完成。经体外分离、扩增、传代培养后，获得第3代（P3）经鉴定符合以下标准：（1）体外培养呈长梭形，旋涡状克隆生长；（2）高表达 CD105、CD90、CD29，不表达 CD34、CD45；（3）体外可诱导分化为神经、骨、软骨、脂肪细胞；（4）可分泌多种生长因子、炎症调节因子和外分泌体。UCMSC治疗方法：将P3 UCMSC用生理盐水稀释为1×106细胞/ml悬液，采用后肢隐静脉输入法按1×106个细胞/kg的剂量输入老年UCMSC治疗组猕猴体内，1次/w，连续治疗3次，其他组不作处理。所有实验猕猴均常规饲养于普通级实验环境，给予充足饮水和饲料。

1.3 外周血单个核细胞的采集及处理 末次UCMSC治疗后30 d，采集各组猕猴外周静脉血5 ml，用等量生理盐水稀释后，置于预先准备好的淋巴细胞分层液上，400 r/min离心20 min，收集单个核细胞；用生理盐水洗涤3次，再用1640培养基稀释成5×106细胞/ml备用。

1.4 LncRNA转录组测序及数据分析 外周血单个核细胞样本交由上海欧易生物医学科技有限公司进行RNA提取、二代测序，并提供原始数据、统计处理、数据库比对、聚类分析、差异分析报告。高通量测序得到的原始图像数据文件经碱基识别分析转化为原始测序序列，使用软件FASTQC对原始数据进行质量评估，使用软件NGS QC TOOLKIT v2.3.3对数据进行预处理，筛选获得转录组数据。lncRNA的筛选方法：（1）使用cuffcompare软件样本转录本与参考转录本进行比对，去除已知编码转录本；（2）筛选到的转录本按长度200 bp和外显子数目≥2 进行再次筛选；（3）使用 CPC、CNCI、Pfam、PLEK软件和数据库[3-6]对筛选得到的转录本进行编码能力预测分析，获得有编码潜能的转录本。

通过上述3步筛选后，最终获得的转录本为本研究预测得到的潜在lncRNA转录本。利用LncRNA的表达量进行主成分PCA分析，对样品分布和实验设计进行验证。利用DESeq软件包比较不同组别的差异lncRNA，并对差异表达lncRNA进行聚类分析，计算多个样品两两之间的距离，构成距离矩阵，合并距离最近的两类为一新类，计算新类与当前各类的距离；再合并、计算，直至只有一类为止。同一类样品能通过聚类出现在同一个簇中，具有相似的生物学功能，用热图展示。

2 结果

2.1 测序数据统计 采用Solexa RNA的pairedend测序法获得了老年组、中年组、幼年组和老年经UCMSC治疗组共12个样本的全基因组转录数据。将获得的原始数据（raw data）进行预处理：（1）去除低质量的reads，质量阈值设置为20，长度阈值设置为70%；（2)从3'端去除低质量碱基：质量阈值设置为20；（3)切除reads中含有未识别碱基的：长度阈值设置为前35 bp。经过预处理，最终获得的数据结果见表1。

表1 LncRNA序列数据统计结果

2.2 LncRNA类型分布及主成分分析 通过生物信息学比较分析获得的lncRNA主要包括基因间lncRNA、内含子lncRNA、反义 lncRNA和有意义重叠lncRNA，其中反义RNA的含量最多，其次是基因间lncRNA和重叠lncRNA（图1）。采用主成分PCA分析法对12个样本的lncRNA数据进行样本分布分析，其中幼年、老年和老年UCMSC治疗组的主成分分布相对集中，中年组存在个体差异（图2）。

图1 lncRNA类型及含量

图2 样品主成分分析

2.3 基因表达量分析 本研究获得的lncRNA转录本的表达丰度结果见表2。差异表达分析采用DESeq软件中的负二项分布检验，计算出各组lncRNA表达差异。老年组与中年组比较，差异表达的基因总数为111个，其中上调表达的48个，下调表达的63个。老年组与幼年组比较，差异表达的基因总数为103个，其中上调表达的54个，下调表达的49个。中年组与幼年组比较，差异表达的基因总数为98个，其中上调表达的52个，下调表达的46个。老年组与老年UCMSC治疗组比较，差异表达的基因总数为109个，其中上调表达的41个，下调表达的68个。

2.4 聚类分析 对筛选获得的差异表达基因进行生物信息聚类分析，结果发现各组IncRNA表达水平均呈现较大差异，总体趋势是部分幼年高表达的IncRNA，在中年和老年时表达降低。 见图3。

3 讨论

lncRNA是一类长度超过200 bp、不具有蛋白编码功能的RNA分子。在哺乳动物基因组序列中，约有4%～9%的序列产生的转录本为lncRNA。研究表明，lncRNA在剂量补偿效应、表观遗传调控、细胞周期和分化调控等众多生命活动中发挥重要作用，参与了X染色体沉积、基因组印记、染色体修饰、转录激活、转录干扰、核内运输等多种重要的调控过程[7]。

表2 转录本丰度分布

图3 各组差异表达IncRNA移动平均线（MA）分析

关于衰老及UCMSC治疗对IncRNA表达的影响研究，国内外报道极少。本研究通过基因转录组测序，获得了猕猴老年、中年、幼年和老年UCMSC治疗后的外周血单个核细胞IncRNA转录本，通过生物信息学筛选和比较分析，找出了不同年龄和老年UCMSC治疗猕猴差异IncRNA及表达变化。结果发现，在不同年龄状态和UCMSC治疗后，IncRNA表达水平存在一定差异，这些差异表达的IncRNA参与了细胞生物过程、功能分子及细胞组成成份基因的表达调控，其主要变化趋势是随着年龄增长，部分幼年高表达的IncRNA表达下调，部分幼年低表达的IncRNA表达上调。值得关注的是，在对老年猕猴实施UCMSC治疗后，衰老状态的低表达IncRNA表达水平升高，而一些高表达IncRNA的表达水平降低，表明衰老状态的IncRNA表达谱发生了向中年或幼年方向逆转，这种变化可能是UCMSC发挥抗衰老效应机制之一。

本研究为生物体衰老及UCMSC抗衰老的基因表达调控机制提供了新的思路和证据，一步将针对差异表达IncRNA的靶基因及在衰老和UCMSC治疗中的生物学功能进行深入，逐步阐明差异IncRNA的调控机制。