三种麻醉药对 C57BL/6 雄性小鼠体表心电图的影响

彭薪元，刘 燕，夏天娇，丁 洁，徐力致

(南京大学医学院，南京 210023)

由于哺乳动物的基本生命过程具有的共性特征使得医学实验中探索生命过程的反应可以部分利用实验动物来替代。然而，不同种属的动物又存在各自的生理特点，其对药效学、药代动力学、毒性等各项反应存在差异，因此只有熟悉并掌握动物的这些差异，才能获得真实的动物实验结果[1]，并将其有效的运用于人类疾病的替代研究中。

心电图描记在生物及医学实验研究中是一种常用的方法。然而由于动物大多数无法配合检测，强制性束缚又会导致心电观察不准，因此多数情况下动物是在麻醉状态下进行心电观测[2]。这就需要考虑不同麻醉药由于其作用机制不同，动物对其反应性所产生的差别[3]，以防止由于麻醉药物的本底影响而导致的实验偏差甚至错误。

本课题组在前期的实验研究中关注到，部分麻醉药作用的小鼠心电波形与麻醉时长存在一定的相关性。因此设计了本实验，以C57BL/6雄性成年小鼠为试验对象，探讨了三种常见动物麻醉药对小鼠心电图的影响，探寻对小鼠心电干扰因素较低的麻醉药及恰当的数据采集时间，以期为环境安全、生命科学及医学研究中涉及小鼠心电图的初步观察提供一定的参考依据，降低因麻醉药使用或观测时间点的选取不当造成的实验失败。

1 材料和方法

1.1 实验动物

SPF级C57BL/6雄性成年小鼠24只，10～12周龄，体重25～32 g，小鼠购自南京大学模式动物研究所[SCXK(苏)2015-0001]，按照标准操作规程饲养于清洁级ICV动物房中[SYXK(苏)2014-0052]， 自然光照、恒温20℃ ～ 22℃、恒湿60% ～ 70%，自由饮用无菌去离子水，喂养SPF级小鼠维持型饲料(江苏省协同医药生物工程有限责任公司)。所有动物实验符合南京大学医学院附属鼓楼医院实验动物伦理委员会要求。

1.2 主要试剂与仪器

RM6240多道生理信号采集处理系统(成都仪器厂)，银针型电极，氨基甲酸乙酯(化学纯，批号：20150123)，水合氯醛(分析纯，批号：20170309)购自国药集团化学试剂有限公司，戊巴比妥钠(分析纯，批号：3G223G27)购自生兴生物技术有限公司。药品均使用上海百特医疗用品有限公司购买的0.9%氯化钠溶液(批号：S1610052)进行配置。氨基甲酸乙酯与0.9%氯化钠溶液比例为0.2 g/mL配置成20%的氨基甲酸乙酯溶液；水合氯醛与0.9%氯化钠溶液比例为0.025 g/mL配置成2.5%的水合氯醛溶液；戊巴比妥钠与0.9%氯化钠溶液比例为0.01 g/mL配置成1%的戊巴比妥钠溶液。

1.3 实验方法

1.3.1 实验分组

所有小鼠随机分配为三组，每组8只，分别为： 20%氨基甲酸乙酯组、2.5%水合氯醛组、1%戊巴比妥钠组。

1.3.2 麻醉

所有小鼠实验前禁食12 h。麻醉方式采用腹腔注射麻醉。20%氨基甲酸乙酯溶液麻醉，剂量为7 mL/kg； 2.5%水合氯醛溶液麻醉，剂量为3 mL/kg； 1%戊巴比妥钠溶液麻醉，剂量为10 mL/kg。等待小鼠出现四肢无力，对皮肤疼痛反应消失，判断小鼠已经麻醉完全。

1.3.3 小鼠心电图描记

在干净、光线柔和、无噪音的实验室中，打开 RM6240E多道生理信号采集处理系统及计算机。

将小鼠以仰卧位置于38℃(小鼠正常体温)保温实验台上将3 根银针电极分别插入小鼠脚踝皮下，注意针头与电极的连接须十分紧, 针头切勿插入肌肉(以防出现肌电波)。选择II导联(按照右上肢绿色，左下肢红色，右下肢黑色的顺序，连入 RM6240E多道生理信号采集处理系统，参数设定：扫描速度为40 ms/div，灵敏度为500 μV，连续记1 h的心电图数据，进行统计分析。

RM6240E多道生理信号采集处理系统连续记录心电波形，从初始记录开始，每隔 5 min 读取心率一次，每次记录时间为 10 s；每隔 10 min读取一次 PR间期，QRS群宽度，P波振幅，选择每个时间段中基线平稳的连续5个心搏，分别取其平均值为该时段相应参数测量值。

1.4 统计学处理

用Prism统计软件对各项指标进行处理，组间比较用t检验。以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同麻醉药作用小鼠心电图波形表现

三种不同麻醉药作用于小鼠连续观察1 h，比较初始心电图波形与40 min后波形改变情况，由表1可发现，水合氯醛组心电图波形变化主要表现为间期随时间延长；戊巴比妥钠组呈现出两种主要波形，4只表现为S波较深型，4只变现为S波较浅型，且两种波形均表现为间期随时间延长；氨基甲酸乙酯组在初始时的心电图与40 min时的心电图波形基本一致，无明显变化。

表1 三种麻醉药作用下心电图波形变化情况Table 1 Changes in ECG of C57BL/6 mice by three anesthetics

表2 不同麻醉药对小鼠心率的影响Table 2 Effect of different anesthetics on heart rate in the C57BL/6 mice

注：与麻醉初始比较(0 min)，aP<0.05,bP<0.01。

Note. Compared with 0 min，aP<0.05,bP<0.01.

2.2 不同麻醉药对小鼠心率的影响

表2显示，氨基甲酸乙酯组的平均心率明显高于水合氯醛组和戊巴比妥钠组(P<0.01)，并且维持在这一高水平。水合氯醛组和戊巴比妥钠组小鼠的心率随时间延长均表现为受到抑制。与初始值(0 min)相比，戊巴比妥钠组在10 min～20 min存在心率明显降低(P<0.01),其后逐渐趋于稳定；水合氯醛组在15 min左右心率明显降低(P<0.01)，随后心率逐渐趋于平稳。

2.3 不同麻醉药对心电图PR间期的影响

氨基甲酸乙酯组在实验全程PR间期基本不变，水合氯醛组以及戊巴比妥钠组PR间期延长(图1)。

注：与麻醉初始比较(0 min)，aP<0.05,b P <0.01。图1 不同麻醉剂对小鼠PR间期的影响Note. Compared with 0 min， a P <0.05,b P <0.01.Figure 1 Effect of different anesthetics on the PR interval in the EGG of C57BL/6 mice

2.4 不同麻醉剂对小鼠QRS群宽度的影响

戊巴比妥钠组QRS宽度明显增长，水合氯醛组和氨基甲酸乙酯组QRS群宽度无明显变化(P>0.05)(图2)。

图2 不同麻醉剂对小鼠QRS群宽度的影响Figure 2 Effect of different anesthetics on QRS duration in the EGG of C57BL/6 mice

2.5 不同麻醉剂对心电图P波振幅的影响

水合氯醛组P波振幅无明显变化，戊巴比妥钠组10 min时有抬高，但无统计学意义(P>0.05)。氨基甲酸乙酯组振幅不随时间有明显变化。(图3)

图3 不同麻醉剂对小鼠P波振幅的影响Figure 3 Effect of different anesthetics on the P-wave amplitude in C57BL/6 mice

3 讨论

实验动物学在现代生命科学和医学研究中起着重要作用，伴随着人类文明的进步，人们也同样关注动物生存福利。科学研究者们依循 “减少(reduction)、替代(replacement)、优化(refinement)”的“3R”原则，除了在动物进行有创实验前必须实施有效麻醉[4]，减轻动物由实验造成的痛苦外，还应注重优化实验，在确保实验数据的真实有效情况下，尽量减少实验动物的使用量。对于实验进行细致的优化处理，不仅符合当今伦理学要求，更可以保障一些较难重复的实验(譬如环境污染对机体造成的慢性复杂性疾病发生)可以同步获得较多的初期指标(诸如血常规、心功能、肺功能等)，以利于进一步机制的深入探索。

常用动物麻醉药有戊巴比妥钠，水合氯醛，氨基甲酸乙酯，氯胺酮等[5-6]，或者使用两种或两种以上麻醉药比如甲苯噻嗪与氯胺酮组合对动物复合麻醉[7]。由于麻醉药物的浓度和剂量选择在不同研究中较为复杂，尤其在心电图观察中，剂量过多容易造成心电基线不稳。同时麻醉药本身还存在药品不同批号存在药效差异。研究人员根据文献报道[8-11]及本实验室过往经验，利用少量小鼠(2～4只/组)进行了初步预实验，最终确定20%氨基甲酸乙酯7 mL/kg剂量、2.5%的水合氯醛溶液3 mL/kg剂量和1%戊巴比妥钠溶液10 mL/kg剂量均可获得基线稳定的心电图波形。

本研究显示给予20%氨基甲酸乙酯后对小鼠心率前后的影响不明显，而2.5%水合氯醛和1%戊巴比妥钠对小鼠的心率均有一定的抑制作用，这一结果与文献报道一致[12]。

水合氯醛对心脏表现为非迷走神经效应和迷走神经效应双重作用。非迷走神经效应是对心脏代谢的抑制；而迷走神经效应表现为心动徐缓。本研究显示2.5%水合氯醛对小鼠的心率有抑制作用，引起PR间期延长，这与心率的变化对应。QRS波宽度未观察到明显变化，同时对于P波振幅没有明显影响。同时发现2.5%水合氯醛注射20 min后小鼠心电趋于平稳，有报道显示临床口服水合氯醛作为先天性心脏病患儿心脏彩超检查镇静剂[13]，可见其对心脏各项功能影响不大。

本研究发现1%戊巴比妥钠腹腔注射给药后，小鼠心率降低、PR间期，QRS波宽度和 QT 间期均明显延长。有研究指出戊巴比妥钠可延缓房室结-希蒲系统传导，延长心室除极和复极时间，并抑制窦房结自律性[14]，且随麻醉时间延长而加重。这与本实验中所观察到1%戊巴比妥钠引起C57BL/6小鼠QRS波群增宽以及P波振幅下降的现象相符。QRS波群宽度反映的是心室除极和复极的时间，而P波作为心房除极的反映，其电位一部分是由窦房结的动作电位组成，窦房结受到抑制可影响P波振幅。此外戊巴比妥钠作用下，小鼠心电表现较不规律，有文献报到戊巴比妥钠可用于心衰模型的建立[15]，制造急性心功能不全。

本研究中20%氨基甲酸乙酯对小鼠的心率及各波形组份均无较大影响，与之前文献报道的结果相一致[12]。研究发现在氨基甲酸乙酯麻醉状态下，交感神经系统和副交感神经系统对于维持心血管活动仍起张力性作用[16]。因此多数学者认为氨基甲酸乙酯较其它麻醉药对各种心血管反射有更好的保护作用。但是，此作用可能掩盖心血管药物对心肌的基础生理反应，在研究中需加以注意。

“动物麻醉药是动物临床上的一类重要药品，各类动物的个性化需求增大，临床应用广泛；但由于其特殊性，需要严格的监管，临床应用上出现一些困扰，常常出现无法购买到正规药品，或者无药可用的尴尬局面[17]”。而水合氯醛是一类价格低廉、容易获得的正规药品。同时必须指出，水合氯醛作用于中枢神经产生麻醉效果仅为催眠作用，并不具有镇痛作用。此外，腹腔注射水合氯醛与大鼠肠梗阻、腹膜炎和胃溃疡有关，因此不推荐通过腹腔注射进行存活手术[18]。美国兽医协会(AVMA)目前已不推荐水合氯醛用于动物的麻醉及安乐死。因此，国内的研究者在其研究中往往考虑折中的方式进行相关研究，即：仅需其催眠镇静作用进行的相关研究(不涉及手术等创伤)，且不作为存活实验的前期麻醉药。譬如本文的心电图测量以及一些影像学研究，并在进行有效观察后，终止动物生存。

综上所述，20%氨基甲酸乙酯对小鼠心电前后影响不大，但始终处于高心率状态。1%戊巴比妥钠与2.5%水合氯醛均抑制小鼠心率，使PR间期，QRS波宽度明显延长。且水合氯醛在注射20 min后小鼠心电各波形变化趋于平稳。因此，在进行科学研究过程中，选择水合氯醛进行麻醉时，最好在麻醉20 min后再进行相应数据测量，以减少麻醉药自身带来的干扰。

最后还应指出，不同麻醉药甚至同一麻醉药的不同给药剂量，对于同一种属不同年龄阶段的动物均可造成较大差异[19]，只有做出精细的实验设计，才能真正获得安全、可靠的实验数据，才能完成动物实验真实的价值。