姜黄素对沙漠干热环境中暑大鼠血液和组织中性粒细胞的影响

张东辉，刘江伟*，康 燕，许 琴，李建瑛，李佳佳，是文辉， 董 翔， 马 娜，宋来阳

(1.新疆军区总医院新疆特殊环境医学重点实验室，乌鲁木齐，830000; 2.解放军69240部队医院，乌鲁木齐，830000)

重症中暑即热射病是一种危及生命的急性热致疾病，临床表现为“类脓毒症”，普遍认为这是肠源性内毒素进入血液循环，这类热源作用于下丘脑的视前区—下丘脑前部的热敏神经元，导致体温调定点上升，体温逐步上升，高热本身可损伤脏器组织细胞，导致细胞变性、坏死和凋亡，同时白细胞数量，尤其中性粒细胞数量明显增加，最终导致多种脏器功能衰竭危及生命[1-2]。推测中性粒细胞在血液和组织浸润中的变化可能在沙漠干热环境中暑的组织损伤及多器官功能障碍中起重要作用。本课题组前期研究发现姜黄素预处理能够延长沙漠干热环境中暑大鼠的生存时间，并且未见明显毒性[3]。姜黄素对沙漠干热环境中暑多脏器保护作用机制是一个正在研究的课题，除本课题组的研究外，国内外鲜有报道，本研究探讨姜黄素预处理对沙漠干热环境中暑大鼠血液和回肠、肝、肾、肺组织中的中性粒细胞数量变化的影响，以期从中性粒细胞角度探讨姜黄素对中暑大鼠多脏器保护的可能机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物

SPF级SD大鼠160只(雄性、6～8周龄、体重220～260 g)，由新疆维吾尔自治区实验动物研究中心提供，实验动物生产合格证号[SCXK(新)2016-0001]。SD大鼠饲养于新疆军区总医院实验动物科SPF环境独立通气笼[SYXK(新)2016-0003](温度：(25±2)℃；相对湿度：40～70%)中常规饲养一周。本实验经新疆军区总医院实验动物伦理与福利委员会审查通过。

1.2 主要试剂与仪器

全自动生化分析仪(深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司，BS-180)、全自动血液细胞分析仪(深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司，BC-2800Vet)、羧甲基纤维素钠(上海源叶生物科技有限公司， 300～800 mpa.s)、姜黄素(东京化工业株式会社，天然物(CI-75300))、西北特殊环境人工实验舱(新疆军区总医院研制)。

1.3 实验方法

1.3.1 实验分组

将160只健康雄性大鼠随机分为4组： 对照组(盐水组)：生理盐水灌胃；姜黄素低剂量预处理组(低剂量)：姜黄素5 mg/100 g+0.5%羧甲基纤维素钠溶液；姜黄素中剂量预处理组(中剂量组)：姜黄素10 mg/100 g+0.5%羧甲基纤维素钠溶液；姜黄素高剂量预处理组(高剂量组)：姜黄素20 mg/100 g+0.5%羧甲基纤维素钠溶液。以上溶液配成混悬液摇匀待用，按照1 mL/100 g灌胃，每日1次，连续灌胃7 d。

1.3.2 模型建立及取材方法

大鼠连续灌胃7 d，第8天转移到西北特殊环境人工实验舱内，将气候模式设定为沙漠干热环境：(41±0.5)℃，相对湿度(10±1)%，大鼠进舱前，可随意饮水，禁食12 h。大鼠进舱后禁食禁水，可在笼内自由活动。按0 min、50 min、100 min、150 min时间点从舱中每组取出10只大鼠，腹腔注射3%戊巴比妥钠，大鼠麻醉后，剪开腹腔，下腔静脉采血，用于中性粒细胞数检测；取150 min组大鼠回肠、肺、肝、肾置于福尔马林固定、脱水、切片、HE染色、镜下观察，描述组织病理变化；于40×10倍镜下观察10个视野，记录组织中性粒细胞数，计算单个视野内中性粒细胞平均数。

1.4 统计方法

2 结果

2.1 姜黄素对干热环境不同阶段中暑大鼠血液中性粒细胞影响结果

结果显示盐水组、姜黄素低、中、高浓度组血液中性粒细胞在0 min至50 min时呈上升趋势，盐水组和低浓度组在50 min明显高于0 min，具有显著性差异(P<0.01)，中浓度组和高浓度组虽然在50 min高于0 min，但无显著性差异(P>0.05)。从50 min至150 min血液中性粒细胞呈下降趋势，其中在盐水组和低浓度组，50 min、100 min和150 min三个时间点之间均存在显著性差异(P<0.01)，在中浓度组，100 min、150 min与50 min之间均有显著性差异(P<0.01)，但100 min与150 min之间无显著性差异(P>0.05)；在高浓度组，仅在150 min明显低于50 min(P<0.01)，区域各时间点之间无显著性差异组(P>0.05)。在100 min时，高浓度组明显高于盐水组(P<0.05)；在150 min时，高、中浓度组中性粒数明显高于盐水组和低浓度组(P<0.01或P<0.05)，提示中、高浓度姜黄素预处理组可以阻止血液中性粒细胞的数量下降减少，其中以高浓度组更加明显。见表1。

2.2 肝、肾、回肠、肺病理镜下观察结果

2.2.1 肝

第150 min重度中暑状态时，盐水组肝组织中肝细胞颗粒样变，肝窦扩张充血较为严重，窦细胞体积增大，肝窦中有较多中性粒细胞浸润；第150 min姜黄素高剂量组肝组织中肝细胞颗粒样变，轻微肿胀，肝窦狭窄，局部肝窦充血，窦细胞体积增大，肝窦中中性粒细胞明显减少。见图2。

2.2.2 肾

第150 min盐水组肾肾小球丝球体中血管扩张充血，丝球体细胞变性，有较多中性粒细胞浸润，肾小球囊腔狭窄，部分肾小球周围远曲管上皮细胞肿胀，颜色变浅，可见管型；姜黄素高剂量组肾小球丝球体细胞轻微肿胀，中性粒细胞浸润数量明显减少，周围肾小管上皮轻微浊肿。见图3。

2.2.3 回肠

第150 min盐水组粘膜上皮细胞变性坏死脱落，部分粘膜固有层中细胞变性坏死较多，细胞数量明显减少，并有大量中性粒细胞浸润；姜黄素高剂量组部分粘膜上皮细胞核浓缩，上皮结构较为完整，粘膜固有层周边血管扩张充血，固有层中可见少量中性粒细胞浸润。见图4。

注：a:100 min时，各浓度组与盐水组比较，P<0.05； b:150 min时，各浓度组与盐水组比较，P<0.01，c:各浓度组与低浓度组比较，P<0.05，d: 各浓度组与低浓度组比较，P<0.01； e：各时间组与0 min组比较，P<0.01；f：各时间组与0 min组比较，P<0.05；g：各时间组与50 min组比较，P<0.01；h：各时间组与100 min组比较，P<0.01；j：各时间组与100 min组比较，P<0.05。

Note. a, At 100 min, each concentration group compared with the saline group,P< 0.05. b, At 150 min, each concentration group compared with the saline group,P< 0.01. c, Each concentration group compared with the low concentration group,P< 0.05. d, Each concentration group compared with the low concentration group,P< 0.01. e, Each time group compared with the 0 min group,P< 0.01. f, Each time group compared with the 0 min group,P< 0.05. g, Each time group compared with the 0 min group,P< 0.05. h, Each time group compared with the 100 min group,P< 0.01. j, Each time group compared with the 100 min group,P< 0.05.

图2 第150 min 盐水组(a)与150 min 姜黄素高剂量组(b)的肝组织病理图片。HE染色Figure 2 Histological images of the liver tissues of the 150 min saline group (a) and 150 min curcumin high dose group (b). HE staining.

图3 第150 min盐水组肾小球(a)、第150 min盐水组肾小管管型(b)和第150 min姜黄素高剂量组肾小球(c)的病理学变化。HE染色Figure 3 Histopathological changes in the kidney tissues showing a glomerulus (a) and urinary cast (b) of the 150 min saline group, and a glomerulus of the 150 min curcumin group (c). HE staining.

图4 回肠组织的病理学变化, a: 第150 min盐水组；b: 第150 min姜黄素高剂量组。HE染色Figure 4 Histopathological changes of the ileum tissues of the 150 saline group (a) and 150 min curcumin high dose group (b).

2.2.4 肺

第150 min盐水组肺泡数量减少，部分肺泡上皮细胞核淡染肿胀，部分上皮细胞变性坏死脱落至肺泡腔中，肺泡间隔明显增厚，间隔中毛细血管扩张充血，可见较多中性粒细胞浸润；姜黄素高剂量组肺泡间隔轻微增厚，间隔中部分毛细血管扩张充血，可见少量中性粒细胞浸润。见图5。

图5 肺组织的病理学变化，a: 第150 min盐水组；b: 第150 min姜黄素高剂量组。HE染色Figure 5 Histological changes in the ileum tissues of the 150 min saline group (a) and 150 curcumin high dose group (b). HE staining.

2.3 姜黄素对干热环境第150 min大鼠各组织中性粒细胞浸润数量影响结果

镜下观察结果显示：第150 min回肠、肝、肾、肺的中性粒浸润数随着姜黄素预处理浓度的增加，均呈下降趋势，中、高浓度组中性粒细胞数明显低于低浓度组和盐水组(P<0.01)，低浓度组和盐水组之间差异无显著性(P>0.05)，除了回肠的中、高浓度组之间差异具有显著性外(P<0.01)，肝、肾、肺的中浓度组与高浓度组之间差异无显著性(P>0.05)提示中、高剂量的姜黄素预处理在一定时间内可以减少浸润到组织的中性粒细胞数量。见表2。

表2 第150 min姜黄素各剂量组回肠、肝、肾、肺组织中镜下中性粒细胞计数结果Table 2 Neutrophils counts in the ileum, liver, kidney, and lung tissues of 150 min groups

注：a：各浓度组与盐水组比较P<0.01；b: 各浓度组与低剂量姜黄素组比较，P<0.01；c: 各浓度组与中剂量姜黄素组比较，P<0.01。

Note. a，Each concentration group compared with the saline group,P< 0.01. b， Each concentration group compared with the curcumin low dose group,P< 0.01. c， Each concentration group compared with the curcumin medium dose group,P< 0.01.

2.4 干热环境大鼠血液中性粒细胞数与各组织浸润的中性粒细胞数相关性分析结果

各组在放置150 min时达到热射病状态时，血液中性粒细胞数与各组织浸润的中性粒细胞数进行Pearson相关性分析(资料符合二元正态性分布)发现血液中性粒细胞数与组织中性粒浸润数呈明显负相关，其相关系数分别为：回肠(r=-0.482，P=0.002)；肝(r=-0.339，P=0.032)；肾(r=-0.563,P=0.000)；肺(r=-0.360，P=0.022)。

3 讨论

中性粒细胞具有很强的变形运动能力，能吞噬、消化细菌及机体本身的坏死组织和衰老的红细胞，故有防御病菌和清除坏死组织的作用。它是机体发生急性炎症时的主要反应细胞。重症中暑时肠粘膜病变，通透性增大，内毒素进入血液循环，血液中的中性粒细胞数量明显增加，同时体温上升，高热本身可损伤脏器组织细胞，导致细胞变性、坏死和凋亡，此时血液中性粒细胞以变形运动穿出毛细血管大量进入组织中，在坏死组织中清除组织碎屑，而死亡的中性粒细胞会释放出一些因子，进一步损伤周围的组织[4]。本次研究发现沙漠干热环境中暑大鼠盐水组、溶剂组、姜黄素低浓度组在特殊环境人工实验舱干热环境[(41±0.5)℃，相对湿度(10±1)%]中放置50 min，血液中性粒细胞数量均呈上升趋势，随时间延长至150 min，各组血液中性粒细胞数量均呈下降趋势，姜黄素高浓度和中浓度组组血液中性粒细胞数量下降明显减少，尤其以高浓度组更加明显。这表明一定浓度的姜黄素可延缓血液中性粒细胞进入组织的时间。通过病理学观察发现组织中的中性 粒细胞数量增多与血液中性粒细胞数下降呈显著呈负相关，血液中的中性粒细胞数量越少越多，组织中的中性粒细胞浸润数量越多，组织病变越严重。提示姜黄素可能在一定程度上减少中暑大鼠血液中中性粒细胞向组织中转移和浸润的数量来减少组织的损伤，因而认为姜黄素预处理在中暑中发挥脏器保护作用与姜黄素抑制组织中性粒浸润有密切关系。

姜黄素对沙漠干热环境中暑过程中多脏器保护作用的机制是多方面的，前期研究发现姜黄素对沙漠干热环境中暑大鼠脏器组织细胞有直接的保护作用。针对沙漠干热环境中暑大鼠的脑、肾、肝等脏器研究中发现姜黄素能够抑制细胞内氧化应激和炎症反应，由于氧化应激和炎症反应与细胞线粒体损伤有关，推测其机制可能是姜黄素对细胞线粒体有保护作用[5-7]。前期研究还发现，沙漠干热环境中暑大鼠姜黄素预处理组在特殊环境人工实验舱高热环境中体重降低速率明显低于盐水组，即姜黄素预处理组失水速率小，且发现姜黄素在干热环境中能够维持血液中较高的 pO2、减缓血液pH值降低、维持血液中糖、甘油三酯能量物质于较高水平，从而推论姜黄素通过维持机体内环境的相对稳定，降低组织细胞缺血缺氧的程度，减轻组织病变，发挥对沙漠干热环境中暑大鼠损伤保护作用[8]。本研究提示姜黄素可能通过减少组织中中性粒细胞的浸润来发挥脏器保护作用。

临床上中暑患者血液中性粒细胞呈上升趋势[9]，本研究发现，在中暑早期血液中中性粒细胞上升明显，随着中暑进展血液中中性粒细胞呈逐渐下降趋势，推测中性粒细胞可能通过损伤的血管内皮发生了“转移”。 Roberts 等[10]的狒狒中暑模型研究发现，在严重中暑，出现微血管内皮损害，白细胞发生透过血管壁迁移现象，同时发现激活的血小板和中性粒细胞黏附于血管内皮细胞，存在着血小板、中性粒细胞和血管内皮细胞的相互作用。血小板减少常常作为判断重症中暑病情加重的指标之一，研究人员认为，若在中暑进展过程中出现中性粒细胞减少常常预示着病情加重，较多的中性粒细胞通过损伤的内皮迁移到脏器组织，增加了组织中性粒细胞的浸润，从而加重了组织损伤。因此中性粒细胞的减少也可作为判断中暑病情加重的诊断指标。

总之，无论姜黄素直接作用于细胞还是维持机体内环境的相对稳定来发挥中暑大鼠的多脏器保护作用，本研究首次提出，姜黄素可能通过减少血液中性粒细胞的向组织中浸润和转移来发挥中暑脏器的损伤保护作用。