玉米醇溶蛋白-多酚纳米颗粒对Pickering乳液稳定性的调控

唐瑜婉，王启明，杨雅轩，李富华,2，赵吉春,2，明建,2*

1(西南大学 食品科学学院，重庆，400715) 2(西南大学 食品贮藏与物流研究中心，重庆，400715)

牛奶、奶油、冰淇淋、黄油等食品中均含有乳液体系，通常需要加入乳化剂来提升乳液稳定性。乳化剂包括表面活性剂、蛋白质、多糖及颗粒乳化剂等。随着消费者对“绿色、安全”需求的日益增长，pickering乳液的稳定剂——颗粒乳化剂由于其安全性和抗聚结性受到消费者的青睐，但是适合作为颗粒乳化剂的天然可食用材料非常有限[1]。zein作为少数富含脯氨酸的两亲性蛋白，能够自组装形成纳米颗粒，稳定乳液。但是zein颗粒在中性条件下不稳定，容易发生聚集，限制其发挥对乳液的稳定作用，且zein颗粒不能解决乳液易被氧化的问题。在自组装系统中引入多酚是解决这些问题的潜在途径，蛋白质脯氨酸含量越高与多酚的结合能力越强，与多酚的结合能调控zein的自组装行为并提升其抗氧化活性[2-3]。文章综述了玉米醇溶蛋白-多酚纳米颗粒(zein-polyphenol nanoparticles, ZPNPs)的制备机理以及对pickering乳液稳定性的调控和应用，以期为开发具有抗氧化能力的乳液稳定剂提供参考。

1 玉米醇溶蛋白纳米颗粒概述

1.1 乳液

乳液是指两种互不相溶的液体，一种液体以液滴形式均匀分散在另一液体中。随着分散程度的增加，界面和界面能也随之增加，通常需要第三相——乳化剂来稳定乳液[3]。

二十世纪初，RAMSDE[4]发现纳米尺寸的固体颗粒可以稳定乳液，pickering对这种乳液体系开展了系统的研究，因而此类由颗粒乳化剂稳定的乳液被称为pickering乳液[5]。pickering乳液是动力学和热力学稳定的体系，固体颗粒对乳液的稳定机理是分散的固体颗粒吸附在油/水界面形成物理屏障，从而阻止乳液液滴之间的聚集[6](图1)。与传统表面活性剂稳定的乳液相比，pickering乳液具有突出优势：抗聚结的长期性、对环境友好、减少脂肪和热量、生物活性物质递送等[7-8]。但适合作为pickering乳液颗粒稳定剂的天然可食用材料非常有限，目前已发现有细菌纤维素、藜麦淀粉颗粒、蛋白质、脂肪结晶体、黄酮类物质等。而zein作为两亲性的水不溶性蛋白，能通过自组装形成纳米颗粒，可作为新型颗粒稳定剂材料，在稳定乳液方面起着重要作用。

图1 传统乳化和Pickering乳化示意图[6]Fig.1 Schematic diagram of traditional emulsification and pickering emulsification

1.2 玉米醇溶蛋白纳米颗粒(ZNPs)

zein是由二硫键聚合体组成的蛋白质，平均分子量为44 000 Da[3, 9]。zein实际上是由不同分子大小、溶解度和电荷的肽美组成的混合物，商业zein至少是α-、β-、γ-和δ-zein 4种的混合物[10]。

zein富含非极性氨基酸如：亮氨酸(20%)、脯氨酸(10%)和丙氨酸(10%)，酸性和碱性氨基酸较少，这导致zein不溶于水，溶于60%～95%乙醇水溶液[9]。并且由于它含有3/4的亲脂性氨基酸和1/4的亲水性氨基酸[10]，因此具有两亲性(疏水/亲水性)，使得zein能够自组装形成纳米颗粒[11-13]。另外，zein对消化酶具有抗性，所以在胃肠道中的消化较慢，可用于控释zein颗粒中负载的功能组分。这些性质使zein成为生产功能性纳米颗粒的良好材料[14]。

DE FOLTER等[1]通过反溶剂沉淀法制备了zein自组装颗粒，用80 nm左右的颗粒作为pickering乳液稳定剂，制备出粒径为10～200 μm的乳液。然而，ZNPs在中性条件下不能稳定的存在于水相中，且悬浮液冻干后无法复溶，表面过于疏水也制约ZNPs稳定的水包油型pickering乳液的构建[3]。而且乳液类食品含有脂质，极易被氧化，不仅造成营养损失、有害物质的生成、改变食品色、香、味，更为严重的是产生细胞和基因毒性，严重危害人体健康[15]。目前对食品级pickering乳液的制备和物理稳定性表征已有较多研究，而对其降低脂质氧化方面的研究却进展缓慢[3]。ZNPs不能解决乳液易被氧化的问题。因此，急需寻找一种新材料用于改善ZNPs的稳定性和抗氧化活性。

1.3 玉米醇溶蛋白-多酚纳米颗粒(ZPNPs)

多酚是植物体内重要的次生代谢产物，含有由羟基连接的苯环结构[16]，具有较强的抗氧化、抑菌、抗癌、抗衰老等功能活性[17-18]。

食品级胶体结构，例如纳米颗粒、复合物和微胶囊，可以通过食品大分子与大/小分子化合物间的相互作用来产生。蛋白质、多糖、多酚两者或者三者之间的相互作用是食品行业中制备纳米结构的基础。目前利用蛋白与多酚的相互作用来制备纳米颗粒已有许多报道[2, 7, 19-20]。蛋白质脯氨酸含量越高，与多酚的结合能力越强，因此，zein作为一种富含脯氨酸的疏水性蛋白，能通过自组装和与多酚复合形成纳米颗粒。多酚的引入不仅可以调节zein的自组装过程，提升纳米颗粒的稳定性，还能提升乳液的抗氧化活性。

2 ZPNPs的制备方法

自组装是各种原子、分子、微纳米粒子等在非共价相互作用下自发组织或聚集成具有一定规则几何外观结构的过程，是制备纳米颗粒实用而有效的方法[7]。zein具有两亲性，因此能自组装形成纳米颗粒。这种自组装特性是制备zein复合纳米颗粒的基础，常用于制备ZPNPs的方法有反溶剂法、喷雾干燥法和超临界反溶剂法[3]。

2.1 反溶剂沉淀法

基于zein特殊的溶解性[9]，反溶剂沉淀法是最常用于制备ZNPs的方法(图2)：将zein的储备液剪切到大量去离子水中形成小液滴。由于乙醇和水的优异混溶性，分散液滴中的乙醇会大量溶到水中。当分散液滴中的乙醇浓度降低至zein溶解极限以下时，zein变得不溶并且突然形成球形纳米颗粒[10, 14]。

图2 反溶剂沉淀法制备球形ZNPs示意图[15]Fig.2 Schematic diagram of spherical zein nanoparticles prepared by anti-solvent precipitation method

如果非极性功能成分能与zein共同溶解在乙醇水溶液中，则通过反溶剂沉淀法可以很容易地将其包封在ZNPs中[21]。已知多酚与富含脯氨酸的蛋白质能发生强烈的非共价相互作用(例如氢键和疏水相互作用)[22-23]，又基于多酚在低级醇中具有优异的溶解性，使用反溶剂沉淀法可以将其包封在zein中制备成复合颗粒[14]。反溶剂沉淀法制备的ZNPs通常为球形。但是，通过简单地改变沉淀介质的黏度，也可产生非球形颗粒。

2.2 喷雾干燥法

喷雾干燥法可通过喷雾干燥器制备纳米至亚微米尺寸范围内的各种聚合物颗粒。此方法将液体通过雾化器，喷洒成雾状液滴，并依靠干燥介质(热空气)与雾滴均匀混合，进行热交换和质交换，使水分汽化，从而脱除物料中的物理结合水和机械结合水，形成核并最终生长成固体颗粒[8](图3)。粒径可通过原料中溶质浓度和液滴大小调节。颗粒的形态受雾化器类型、溶剂蒸发速率和干燥过程中的溶质扩散系数等影响[24]。XIAO等[25]将zein和活性成分(溶菌酶或乳酸链球菌素或百里香酚)的混合乙醇溶液进行喷雾干燥，得到包埋活性成分的微米级zein颗粒。

图3 制备zein微/纳米颗粒的喷雾干燥方法和电喷雾技术[8]Fig.3 Spray drying method and electrospray technology for preparing zein micro/nanoparticles

2.3 超临界反溶剂法(supercritical anti-solvent, SAS)

SAS是一种制备营养物递送和控释的纳米颗粒的有效方法[26]。超临界二氧化碳(CO2)作为反溶剂，具有温和的操作温度、对环境友好、易于控制等优点。超临界流体提高溶液分散是SAS工艺之一，用此方法将溶解有zein和多酚的有机溶剂(如乙醇水溶液)与超临界反溶剂混合(二者需要能够混溶)，随着从雾化液滴中连续提取共溶剂，zein和多酚逐渐失去其溶解性，形成核并生长成固体颗粒。

以溶解有zein及活性成分的有机相为溶剂，以超临界流体(CO2)作为反溶剂，将二者通过SAS装置混合，最终制备出负载活性成分的zein颗粒[3]。HU等[27]制备了叶黄素/zein纳米颗粒，制备过程中压力、温度、叶黄素/zein的比例和溶液流速等均能显著影响颗粒的形态、载药量、包封效率和平均粒径。

2.4 其他方法

其他方法包括闪纳米沉淀法、乳化/沉淀法、化学交联、冷胶凝等。闪纳米沉淀法是一种相对新型的制备胶状纳米颗粒的技术，它在聚合物固化之前将溶剂与抗溶剂以短时间内快速混合的方式来达到既定效果[28]。乳化/沉淀法是将含有药物和zein的水溶液乳化到负载表面活性剂的油中以获得油包水乳液，其中水相用作载体制备的模板，初始水溶液需保持碱性，之后引入可溶于油的酸(如冰醋酸)将其pH值调节至接近中性(6.0)，zein不溶于中性溶液会沉淀并聚集成不同大小的颗粒[8]。此外，化学交联、冷胶凝等也可用于制备zein纳米颗粒[8]，但由于这些方法往往使用有毒化学溶剂、操作复杂或者效果不理想，在食品行业中应用较少。

3 ZPNPs对pickering乳液稳定性的调控

影响pickering乳液稳定性的因素很多，主要包括固体颗粒(类型、表面润湿性、粒径、浓度等)、水相(pH、电解质、温度、离子强度等)以及其他(油相性质、油水比、形成乳液液滴大小等)[6,29-30]。这些因素通过影响乳液的亲水/油性、界面能、黏度等来影响乳液稳定性。ZPNPs不仅具有良好的封装、传递和控释功能，而且在调控乳液稳定性方面具有重要意义。

3.1 ZPNPs对pickering乳液稳定性的影响

由于自组装的ZNPs的固有聚集倾向，对乳液的稳定作用有限[31]。DE FOLTER等[1]采用未改性的ZNPs稳定pickering乳液，发现它的乳化非常不稳定，而且水相混浊。

在自组装系统中引入多酚，zein能够被多酚涂覆或包裹，从而形成复合纳米颗粒，改善zein在反溶剂过程中的自组装行为。这种络合作用能够进一步抑制多酚的电离，并且在酸性pH下诱导ZNPs表面羟基的增加，减少了它们的疏水性而没有显著降低表面电荷，这使复合纳米颗粒具有接近中性的润湿性和增强的反应性，进一步促进油滴的油-水表面上的多层界面结构，从而形成pickering乳液。此外，氢键结合进一步触发纳米颗粒之间的交联，在油滴之间和周围形成连续的网络，形成稳定的乳液凝胶[2](图4)。

图4 用zein/ TA复合纳米颗粒制备的Pickering乳液凝胶形成机理示意图[2]Fig.4 Schematic diagram of the formation mechanism of pickering emulsion gel prepared by zein/TA nanoparticles

ZOU等[2]通过单宁酸(tannic acid, TA)和zein制备出稳定pickering乳液的纳米颗粒，结果表明zein和TA的络合是由于非共价相互作用(主要是氢键)，这比zein-硬脂酸钠复合物中的疏水相互作用更具特异性。TA具有抗氧化和抗菌性能，使乳液不易被氧化变质，具有优异的化学稳定性和健康益处，可以开发为新型功能性食品成分。

王永辉[32]利用zein水解物(ZH)和TA的相互作用制备了ZH-TA非共价纳米复合物，能够应用于以海藻油为代表的功能性油脂或脂溶性活性物质纳米乳液输送体系的构建，该乳液体系不仅对海藻油具有较高的包埋率，其在长期储藏过程中还表现出了良好的物理稳定性，该体系对功能性油脂具有超强的抗氧化保护。

朱美如[33]利用反溶剂沉淀法制备了富含芦丁(rutin, R)的ZNPs，并进一步均质制备pickering乳液。有效地促进了zein对疏水性R的包埋，且保留了R的抗氧化活性；相较于zein单独稳定乳液，zein-R复合纳米颗粒不仅提高了pickering乳液的稳定性，还提高了其抗氧化能力。

可见ZPNPs可以作为一种绿色可食用的pickering乳化剂，在功能食品中具有良好的应用前景。

3.2 ZPNPs调控pickering乳液在功能食品中的应用

3.2.1 稳定、包封和控释活性成分

zein和多酚本身即为2种功能成分，引入乳液体系后能增加其营养价值和健康功效。pickering乳液能包封功能成分，如蛋白质、生物活性成分(维生素、多酚等)、活细胞(益生菌)，可用于食品营养强化[34]。亲脂性化合物通常不能简单地分散在水基产品中，将它们掺入颗粒稳定的乳液体系后，能增强物理/化学稳定性。ZOU等[35]使用zein/TA复合纳米颗粒(ZTPs)稳定的凝胶状pickering乳液包封脂溶性成分(姜黄素)，ZTPs可以在乳液液滴周围形成保护层，抵抗紫外线辐射和胃酸环境，抑制消化酶与乳液液滴的相互作用，从而使脂质摄取缓慢和姜黄素持续释放。

3.2.2 抑制乳蛋白聚集

巴氏杀菌等过程会引起乳制品中乳蛋白的聚集，颗粒聚集过多会导致乳液不稳定。通过美拉德反应产生的β-乳球蛋白-葡聚糖颗粒在温度高于85 ℃且pH值为5时具有增加的热稳定性。纳米颗粒还可以调节和改善乳液(酸奶、奶油等)对pH的敏感性[35]。

3.2.3 响应乳液

许多固体颗粒乳化剂具有环境响应特性，蛋白质颗粒在接近等电点pH时会发生聚集，在zein等电点pH时，zein颗粒稳定的乳液变得不稳定，多分散性急剧增加；因为蛋白质和多酚之间通常是通过氢键、疏水力等相互作用的，蛋白质-多酚复合物颗粒也可以用于制备pH响应乳液。通过体系和环境条件的变化(pH、温度、磁场等)可以改变颗粒的润湿性，进而实现pickering乳液稳定性的调控[36]，实现一种类似开/关的响应。

响应乳液可用于以预定的速率或响应在最佳测定条件下递送和控释生物活性化合物、香料等[37]，也可以用于调控乳液类型(O/W或W/O型)[36]、再乳化和反乳化等。

3.2.4 减轻油脂氧化

为了避免传统饱和脂肪酸和氢化油对健康的威胁，一种可能的方法是使用pickering乳液作为模板形成油凝胶[34, 38]。凝胶状pickering乳液不仅可以提高自身的冻融稳定性，当乳液中油相体积分数高达70%及以上时，可取代氢化植物油在食品中的应用[39]。

另一方面，负载多酚的ZPNPs稳定的乳液能有效的提升抗氧化性和生物利用度，应用于油脂时能提高其抗氧化能力，减轻油脂氧化带来的危害。这不仅是由于多酚本身的抗氧化活性，也是因为pickering乳化使乳液的界面层厚度增大，起到了阻隔氧气以及自由基清除的作用，从而降低了被包覆物质的氧化速率。

4 展望

ZPNPs调控pickering乳液应用于食品体系可以减少食品中脂肪的含量，提高其抗氧化能力，增加体系的稳定性。此外，pickering乳液也可用于生物活性物质的稳定、包埋和释放，提高其生物利用率。由此可见，使用ZPNPs调控pickering乳液在食品中具有广阔的应用前景。

今后可以进一步研究物理、化学、生物因素对纳米颗粒调控pickering乳液稳定性、生物活性等的影响，以制备出更好的应用于食品体系的乳液。另外，继续探寻食品级、营养、便宜、来源广和有效的pickering颗粒稳定剂，仍然是食品行业未来研究的任务之一。

同时值得注意的是，尽管zein是一种公认安全(GRAS)的天然材料，但任何应用于食品体系的材料都要考虑实际安全性，免疫原性是在体内使用材料时要考虑的关键因素，目前关于zein免疫原性的研究较少，且存在较大争议。因此，需要对zein的免疫原性做进一步研究。