海洋细菌低温葡萄糖氧化酶基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

刘春莹，胡善松，张庆芳，李美玉，于爽，迟乃玉*

1(大连大学 生命科学与技术学院，辽宁 大连，116622) 2(辽宁省海洋微生物工程技术研究中心，辽宁 大连，116622)

葡萄糖氧化酶(glucose oxidase, GOD)的系统名称为β-D-葡萄糖氧化还原酶(E.C.1.1.3.4)[1]，最先于1904年在黑曲霉和灰绿青霉中发现[2-4]。它能够催化β-D-葡萄糖被氧化成葡萄糖酸-δ-内酯，进而被水解成葡萄糖酸，并生成过氧化氢[5]。因此，GOD因其具有脱氧和防腐的功能，而应用在食品保鲜方面。GOD还具有消除肠道病原菌、解除肠道霉菌毒素中毒、改善肠道酸性消化环境、保护肠道上皮完整的功能[6-7]，被广泛应用在畜牧业和养殖业[8-9]。由于GOD的专一氧化葡萄糖的特性，在生物传感器、医学检验等领域是重要分析用酶[10-13]。

野生菌株中GOD活力较低，利用基因工程进行改造成为一种有效的手段。20世纪KOVACEVIC等[14]与GUO等[15]在毕赤酵母中成功表达黑曲霉GOD。PULCI等[16]也将青霉GOD的基因成功克隆到酵母中并实现表达。随着GOD需求的增加，我国相关研究也逐渐增多。周亚凤等[17]将黑曲霉GOD基因克隆到酵母中并高效表达。高庆华等[18]也将青霉GOD基因克隆到酵母中并表达。大肠杆菌一直作为外源蛋白表达的首选系统[19]，但很少应用在GOD外源表达方面。现有报道仅WITT等[20]及顾磊等[21]尝试在大肠杆菌中表达黑曲霉GOD。细菌与大肠杆菌的同源性更高，可能更适合在大肠杆菌中表达，但此类的研究此前未见报道。

本研究以海洋细菌Citrobacterssp. 8-III为出发菌株,采用E.coliBL21(DE3)为表达宿主，构建GOD高产大肠杆菌工程菌株，实现GOD在大肠杆菌中的高效表达，并对重组GOD酶学性质进行分析。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 菌株与质粒

Citrobacterssp. 8-III：辽宁省海洋微生物工程中心提供(分离自大连渤海海域，深度约30 m的海泥中。)；E.coliDH5ɑ：构建和克隆目的基因；E.coliBL21(DE3)：表达宿主；质粒pMD9-T：克隆载体；质粒pET-28a(+)：表达载体。

1.1.2 试剂与仪器

PCR相关试剂、克隆相关试剂和限制性内切酶：Takara公司；PCR产物纯化试剂盒等：上海生工生物有限公司；琼脂糖、辣根过氧化物酶和邻联茴香胺等试剂：Sigma公司。

PCR仪和电转化仪，Eppendorf公司；Multiskan1510酶标仪，Thermo Fisher Scientific；LDZX-40BI立式压力蒸汽灭菌锅，上海申安医疗器械厂；LTI-700恒温培养箱，上海爱郎仪器有限公司；HZP-250全温振荡培养箱，上海精宏实验设备有限公司；HD-1360 超净工作台，北京东联哈尔仪器制造有限公司；AL-204电子天平，梅特勒-托利多仪器有限公司；RDY-SP1Z型核酸电泳仪，北京荣阳静电科技有限公司

1.1.3 培养基

LB培养基：10 g/L NaCl、5 g/L酵母提取物、10 g/L蛋白胨；种子培养基：10 g/L蛋白胨、5 g/L牛肉膏、10 g/L NaCl；发酵培养基：60 g/L葡萄糖、3 g/L蛋白胨、2 g/L K2HPO4、0.7 g/L MgSO4、0.5 g/L KCl、4 g/L NaNO3，pH 6.5。

1.2 实验方法

1.2.1 菌株8-III GOD基因的获取

挑取菌株8-III的单菌落于8 mL种子培养基,于25 ℃下160 r/min振荡培养48 h，以2%的接种量接种到含有100 mL种子培养基的250 mL摇瓶中，160 r/min，25 ℃摇床中培养48 h。取2 mL的菌液于8 000 r/min离心，去掉上清液，用PBS洗涤2次，再次离心收集菌体。利用基因组大量提取试剂盒(powermax TMSoil DNA isolation kit)提取基因组DNA。所提DNA送到北京百迈克生物科技有限公司进行DNA质量检测，并使用Illumina Hiseq X10高通量测序平台进行双端测序(PE150)，得基因组草图。对测序数据过滤低质量后，利用Velvet软件[18]进行初步组装，得到最终基因组框架图(draft genome)。根据GenBank公布GOD基因序列通过BLAST比对确定目的基因。交由Synbio Technologies公司对8-III菌株的GOD基因进行基因全长合成，并构建于克隆载体pMD-9-T，命名pMD-9-T-GOD。

1.2.2 目的基因的克隆

5′端引物序列P1为：5′-ATGAAGTCCACTATTATCACCTCCA-3′，其3′端引物序列P2为：5′-CTAGGCACTTTTGGCA-TAGTCTTCA-3′，用这对引物以pMD-9-T-GOD为模板进行PCR扩增。反应体系为50 μL：基因组DNA 100 ng，引物各0.2 μmol/L，dNTPs 250 μmol/L，5×Q5高保真DNA聚合酶缓冲液10 μL，Q5高保真DNA聚合酶0.5 μL。PCR反应条件：98 ℃、5 min；98 ℃、 30 s，65 ℃、30 s，72 ℃、60 s，共30个循环；72 ℃、10 min。PCR产物于1%琼脂糖凝胶上电泳鉴定纯度和分子量的大小。PCR产物经DNA回收试剂盒回收。

1.2.3 原核表达载体的构建

将pET-28a(+)用NcoⅠ和XhoⅠ进行双酶切，与目的基因连接，重组质粒命名为pET-28a(+)-GOD。该表达质粒的构建方式删除了pET-28a(+)质粒载体上的全部标签，可用来构建无标签的基因表达工程菌。将该表达质粒转化至E.coliBL21(DE3)感受态细胞，阳性的转化菌命名为E.coliBL21(DE3)/pET-28a(+)-GOD。送至Synbio Technologies公司测序验证，保存测序正确的菌株。

1.2.4 目的蛋白的诱导表达与纯化

将E.coliBL21/pET-28a(+)-GOD接种于10 mL含卡那霉素的LB液体培养基中，160 r/min，25 ℃，过夜培养。取上述菌液按2%接种量接种于100 mL含卡那霉素的LB液体培养基中，160 r/min，25 ℃培养4 h，加入IPTG诱导表达。收集菌体发酵液于10 000 r/min，4 ℃，离心20 min，弃上清。菌体沉淀以pH 7.4的PBS洗涤，重复洗涤3次。洗涤后用10 mL的PBS重悬。将重悬液超声裂解15 min(开3 s，间隔5 s，功率200 W)。将裂解液以10 000 r/min，4 ℃，离心20 min，上清液为粗酶液。粗蛋白用Ni2+-NTA柱(Novagen)进行亲和层析纯化，洗脱的蛋白液4 ℃保存，蛋白样品经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测，同时以空载体和未诱导作对照，记录并分析结果。

1.2.5 酶活力测定[22]

于96孔板中依次加入5%葡萄糖溶液150 μL，邻联茴香胺溶液150 μL，辣根过氧化物酶溶液10 μL，25 ℃反应10 min，加入待测液10 μL。酶标仪波长460 nm，每间隔1 min测定1次，共测定5次。以在25 ℃，pH 6.5的磷酸缓冲溶液的反应条件下，每分钟将1 μmol的葡萄糖催化氧化为葡萄糖酸和过氧化氢所需要的GOD的量定义为1个GOD的活力单位。根据公式计算酶活[19]。

1.2.6 酶学性质研究

温度对重组GOD影响：将适当稀释的酶液分别在15、20、25、30、35、40、45、50、55、60和65 ℃下进行反应，以酶活最高者为100%计算相对酶活，从而确定该酶的最适作用温度。将适当稀释的酶液分别放到0、10、20、30、40、50和60 ℃下保温1 h，每隔30 min取样，在冰上放置5 min后进行酶活测定。以未进行热处理的酶液的酶活为100%计算相对酶活，确定重组GOD的热稳定性。

pH值对重组GOD影响：配制pH值分别为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0的PBS缓冲体系，将酶液分别用这些缓冲液稀释后进行反应，以酶活最高者为100%计算相对酶活，从而确定GOD酶的最适pH值。分别将酶液在pH值为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5和10.0的PBS缓冲液中保温30 min(温度为25 ℃)，以未经保温处理的酶活为100%计算残余酶活力，从而确定GOD酶的pH稳定性。

金属离子对酶活影响：在GOD酶与其底物进行反应的体系中，加入Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Fe2+、Cu2+、Mn2+、Fe3+、Zn2+、Ba2+及乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA)，使其终浓度为0.35 mmol/L，然后按照1.2.5的方法进行酶活测定。以不加金属离子的反应体系的酶活定义为100%，表示不同金属离子或化合物下的相对酶活。

1.2.7 鸡饲料的应用

将重组GOD纯化后与SiO2以4∶1比例复配后,以0.05%加入鸡饲料中，喂养A组雏鸡;只加入GOD未与SiO2复配的鸡饲料喂养B组雏鸡;以未加入GOD的鸡饲料喂养C组雏鸡。每组12只，喂养14 d，记录平均每日增重、平均每日摄取量、饲料利用率和腹泻率。

1.2.8 幼犬饲料保鲜

将重组GOD纯化后与SiO2以4∶1比例复配后，以0.05%加入幼犬饲料中，为实验组A；以陆生霉菌GOD与SiO2以4∶1比例复配后，以0.05%加入幼犬饲料中，为实验组B；以未加入GOD的幼犬饲料为实验组C。每组50份0.5 kg饲料，4 ℃储藏14 d，记录饲料霉变情况。

2 结果与分析

2.1 目的基因PCR扩增

以pMD-9-T-GOD为模板PCR扩增GOD基因，见图1。

M-DNA Marker；1～4-PCR扩增产物图1 目的基因克隆PCR电泳检测结果Fig.1 PCR assay of the targetgene

目的基因条带单一、浓度较高。经测序其全长为1 292 bp，提交至Genbank所获序列登录号是MK054202，与Genbank中其他GOD基因序列的相似度在92%～98%，预期能够编码含有428个氨基酸残基的蛋白质。对序列进行分析，发现序列中不含有内含子和基因原有的信号肽序列，不含有SacⅠ、NotⅠ和SnabⅠ酶切位点，含有NcoⅠ和XhoⅠ酶切位点，符合之前的预测。

2.2 重组表达载体的构建

分别用NcoⅠ和XhoⅠ对pET-28a-GOD做分步酶切，预期得到大小分别为5.4 kb的载体片段和1.3 kb的目的基因片段。通过1%琼脂糖凝胶电泳对双酶切产物进行检验，结果见图2。泳道1为重组质粒的酶切鉴定结果，大小与预期结果一致，将鉴定正确的质粒进行测序，最终确定重组表达质粒pET28a-GOD。

M-DNA Marker；1-酶切处理的质粒；2-质粒DNA图2 重组质粒pET-28a-GOD的酶切鉴定Fig.2 Restriction pattern of recombinant pET-28a-GOD

2.3 诱导表达与纯化

将经鉴定正确的原核重组表达质粒载体pET28a-GOD转化至表达宿主菌E.coliBL21(DE3)中诱导表达。通过SDS-PAGE分析目标蛋白表达情况。加入IPTG后成功诱导外源蛋白的表达。以没有装载GOD的E.coliBL21/pET28a菌体作为对照，在E.coliBL21/pET28a-GOD菌体裂解液全菌、上清液和沉淀的约46 kDa位置出现一条蛋白带(图3)，该蛋白带分子质量与重组GOD的理论分子质量(46 kDa)相一致，由此推测该蛋白带为诱导表达的GOD。此外，由图(图3泳道2)可见菌体裂解后的可溶部分也检测到GOD蛋白条带，说明克隆菌株不仅能有效表达GOD，而且重组GOD为可溶性表达。

2.4 NI+-NTA柱亲和纯化

通过Ni+-NTA亲和层析柱进行GOD纯化，SDS-PAGE检测洗脱收集液，如图4所示。目标蛋白被150 mmol/L和200 mmol/L咪唑溶液洗脱下来，大小在46 kDa左右，且洗脱液中杂蛋白较少。

M-标准蛋白；1-E. coli BL21/pET28a-GOD菌体裂解液沉淀；2-E. coli BL21/pET28a-GOD菌体裂解液上清液；3-E. coli BL21/pET28a-GOD菌体裂解液全液；4-E. coli BL21/pET28a(+)菌体裂解液上清液图3 目的蛋白GOD的SDS-PAGE检测结果Fig.3 SDS-PAGE analysis of GOD protein

M-蛋白质分子量标准；1-150 mmol/L咪唑溶液洗脱目标蛋白；2-200 mmol/L咪唑溶液洗脱目标蛋白图4 纯化后E. coli BL21/pET28a-GOD的SDS-PAGEFig.4 SDS-PAGE of E. coli BL21/pET28a-GOD after purification

2.5 酶学性质分析

2.5.1 酶最适作用温度

将重组GOD在10～60 ℃处理5 min，结果如图5-a所示。酶的最适反应温度为25 ℃，20～35 ℃相对酶活可以保持在80%以上，40 ℃后相对酶活快速降低。此外该酶在0 ℃时可保持50%相对酶活，符合海洋细菌低温酶特性，在较短的时间产生大量GOD。如图5-b所示，10～35 ℃时，相对酶活可保持80%以上，表明在该温度范围内酶的温度稳定性良好，其中25 ℃酶活最稳定，相对酶活保持在90%以上，40 ℃后稳定性迅速下降。该酶在0 ℃时可保持60%以上酶活力且稳定性快速提升，10 ℃后可达到60%以上酶活力，说明该酶具有低温酶特性，且温度稳定性良好。

a-酶最适作用温度；b-酶的温度稳定性图5 温度对酶活影响Fig.5 Effect of temperature on enzyme activity

2.5.2 酶最适作用pH

如图6-a所示，重组GOD的最适pH值为6.0，在pH值为5.5～6.5时，保持85%以上的相对酶活，表明该酶属于偏酸性GOD。如图6-b所示，该酶在pH 6.5时稳定性最好，在pH 6.0～7.0时相对酶活可保持80%以上，pH 7.5以后稳定性快速降低。推测GOD中可能存在酸性基团，碱性条件下不能稳定存在。在pH 7.5以上会产生结构变化，影响酶活。

a-最适pH值; b-pH稳定性图6 pH对酶活影响Fig.6 Effect of pH on enzyme activity

2.5.3 金属离子及螯合剂对酶活的影响

由图7可知，K+、Ni2+对重组GOD的活性有明显促进作用；Na+、Zn2+、Fe3+、Cu2+、Ag+、Ca2+、Fe2+、Mg2+和EDTA对GOD活性有抑制作用，其中Cu2+、Ag+、Ca2+、Fe2+和Mg2+严重抑制重组GOD酶活性。推测这可能是由于这些离子与酶中心的功能基团结合，进而引起酶失活。

图7 金属离子及螯合剂对酶活力的影响Fig.7 Effects of metalions and chelating agents on enzyme activity

2.6 鸡饲料中应用

将重组GOD添加到鸡饲料中，饲养结果如表1所示。A组雏鸡的平均日增和饲料利用率重要大大高于B、C两组，其中B组又比C组要高。腹泻率C组最高，A组最低。结果表明，重组GOD可以通过改善肠道菌群提升对饲料的有效吸收，从而提升鸡体重。此外，重组GOD需要与相应载体联合使用，单独使用重组GOD效果并不理想。

表1 重组GOD在鸡饲料中应用Table 1 Application of recombinant GOD in chicken feed

2.7 幼犬饲料中应用

重组GOD添加到幼犬饲料中，结果如图8所示。A组的霉变情况最好，C组最差，B组稍好于C组。说明重组GOD确实具备防腐的作用，并且在低温环境也能有很好的作用，这是陆地来源GOD所不具备的。

图8 幼犬饲料霉变情况Fig.8 Mildew of puppy feed

3 结论

GOD是一种重要的应用酶，国内外学者在其外源表达方面已进行大量研究[22-26]。葡萄糖氧化酶最适作用温度为40～45 ℃，在35～50 ℃酶活稳定，属于中高温酶。本文首次尝试将海洋细菌GOD基因在大肠杆菌中表达，并将酶活提升2.72倍。重组GOD分子质量为46 kDa，在25 ℃，pH 6.5的环境下酶活最高，10～20 ℃酶活保持稳定。结果表明，重组GOD具备低温酶特性，可以填补传统陆地来源GOD在饲料保鲜等方面的不足。此外大肠杆菌可用于细菌GOD外源表达。同时，克隆菌株自身具有培养条件简单经济、生长繁殖快速、蛋白表达水平高等优势、遗传背景清晰、基因改造工具多样等特点[15]，与工业生产相契合。

将重组GOD添加到动物饲料中，可起到防腐作用，并提升饲料利用率。重组GOD通过杀灭或抑制病原微生物的生长繁殖维持动物肠道菌群平衡，自身及代谢产物对动物和环境均无毒副作用，且不易诱发耐药菌产生，也不易诱发交叉耐药菌的产生，具备加工为饲料添加剂的潜力。此外，已报到的GOD饲料添加剂绝大多数自身不具备防腐功效[27-28]，重组GOD的低温酶特性，可填补传统GOD在低温领域的空白。在食品保鲜与以低温检测方面有良好的应用前景。