p38丝裂原活化蛋白激酶对人乳牙牙髓干细胞成骨分化能力的影响*

赵振宇 李 影 王 港 朱子鹏 顾 斌

脱落乳牙牙髓干细胞(stem cells from human exfoliated deciduous teeth，SHED)是早期外胚叶间充质组织头部的神经嵴细胞迁移衍生出的牙髓间充质干细胞，属于牙源性干细胞，具有良好的生物学性能，包括较高的增殖能力、自我更新能力、广泛的多向分化能力、且具有一定的免疫调节能力[1,2]。与恒牙牙髓干细胞(dental pulp stemcells，DPSC)相比，SHED具有增殖快、良好而确定的多向分化潜能和取材方便等特性，已经成为口腔组织工程学和再生医学研究中理想的种子细胞[3]。乳牙与恒牙在来源和成牙特性上相近，然而，在结构和组织学上有一定差异，在干细胞功能上同样存在一定差异，但具体机制不清。p38-MAPK信号通路在转导细胞外信号通路中发挥重要作用，是MAPK家族控制炎症反应及成骨分化的重要分子，它可因炎症刺激内霉素和渗透压而激活，从而调控干细胞的迁移、分化和凋亡[4,5]。本研究获取了人SHED及DPSC，将二者的生物学行为进行了系统比较，我们的研究发现SHED的增殖活性剂及成骨分化能力均优于DPSC。随后我们进一步检测在成骨诱导条件下p38 MAPK的活化情况，并特异性抑制p38 MAPK检测其在干细胞成骨分化过程中的作用，明确p38 MAPK在人SHED及DPSC增殖与成骨分化中的作用机制，为二者作为种子细胞的应用提供一定研究基础。

1.材料方法

1.1 材料 胎牛血清，DMEM培养基；0.25%胰蛋白酶(Sigma，St Louis，MO，USA)；青链霉素(Gibco BRL)；链霉素(Gibco BRL)；SB-203580(Selleck，美国)；IL-1β、TNF-α Elisa 试剂盒(上海通蔚生)；ALP染色试剂盒(上海碧云天)实时定量PCR仪IQ5(美国)；RNA抽提试剂盒及逆转录试剂盒Fermentas(美国)；Taq DNA聚合酶、dNTPs和引物上海生物工程公司(中国)；Syber Green荧光定量PCR检测试剂盒Takara(日本)。Western及IP裂解液，BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天公司)；p38，p-p38 抗体 (Cell signaling，美国)；OCN抗体ALP抗体(Abcam，美国)；β-Actin，羊抗兔IgG(北京中杉金桥)。

1.2 样本收集 于解放军总医院第一医学中心口腔门诊收集6岁儿童正常乳恒牙替换期自然脱落乳牙样本。样本数量为8例，其中女童5例，男童3例，脱落乳牙无明显龋坏，无牙髓病变及根尖周炎，牙根吸收达牙根1/2-2/3，且所有纳入个体无系统疾病。DPSC取材于18～20岁青年因正畸治疗拔除的前磨牙或因埋伏阻生而拔除的第三磨牙样本，样本数量为8例，其中男性4例，女性4例。所取得恒牙均无明显龋坏，无牙髓病变及根尖周病变，且所有纳入个体无系统疾病。本研究经医院伦理委员会批准，在患者知情同意的前提下进行。

1.3 SHED和DPSC的原代培养和分离 消毒即将拔除的乳、恒牙牙体周围组织，拔牙，立即置4℃预冷的含双抗DMEM培养液培养瓶内进行原代培养。在超净台中，用含青、链霉素的0.1mL/L PBS液反复冲洗离体牙，无菌条件下仔细取出乳牙及恒牙牙髓组织，0.1mL/L PBS反复漂洗，剪碎至约1mm×1mm×1mm大小的组织块。用4%Ⅰ型胶原酶的培养液消化30min，过70μm细胞筛网，组织块和上清分别采用组织块法和酶消化法培养细胞。前者25mL培养瓶组织块贴瓶，2～4h翻瓶；后者1000r/min离心5min，弃上清，加入含15%FBS的DMEM培养液接种于35 mm培养皿，每3d换液，细胞达到约80%汇合时，胰酶消化传代。采用有限稀释法克隆化培养分离人乳牙牙髓干细胞及恒牙牙髓干细胞[6,7]，逐步扩增，以P3代用于细胞实验。

1.4 酶联免疫吸附试验检测 将第三代DPSCs及SHED以1×105的密度接种到24孔板中，每组设3个复孔。待细胞贴壁后，弃原培养液，PBS冲洗3遍，每孔加入1mL含10%FBS的DMEM培养基，72h后收集各孔内的培养液，离心后取上清液进行ELISA检测。建立标准曲线，按照IL-6、TNF-α ELISA检测试剂盒(上海通蔚生)说明每孔加入待测样品100μl，洗板，随后加入一抗工作液50μl，混匀，37℃恒温孵育60min，洗板，加入酶标抗体工作液100μl反应板充分混匀后置于37℃60min，洗板后加入底物液100μl，置于37℃避光反应10min，最后每孔加入50μl终止液混匀，在450nm处测吸光值。

1.5 成骨诱导试验 将第三代SHED与DPSC以5×104个/mL的密度接种于6孔板中，用10%FBS的DMEM培养至细胞70%汇合后换成骨诱导液(含 5mmol/L β-甘油磷酸钠，50μg/mL维生素C，1×10-8mol/L地塞米松、10%FBS的DMEM培养液)连续培养，每隔3d换液一次，根据不同实验内容进行观察培养。

1.6 碱性磷酸酶染色 SHED和DPSC成骨诱导7d后，弃原培养液，按照碱性磷酸酶试剂盒说明书配制染液，将细胞用PBS洗3次，加4%多聚甲醛固定液，固定30min。PBS洗3次，加ALP染液37℃孵育60min。蒸馏水轻轻冲洗，洗去染液，照相。显微镜下观察染色结果，蓝色为阳性。

1.7 实时定量PCR检测 将SHED和DPSC常规培养及成骨诱导液7d后用Trizol裂解并提取总RNA，测定RNA浓度，分别反转录为cDNA。逆转录所得cDNA利用Syber Green荧光定量PCR检测试剂盒进行荧光定量PCR检测，反应体系均为 20μl。引物序列：IL-1β forward：5'-CCGT GCCTACGAACATGTC-3'，reverse 5'-CACA CAGAAGCTCATCGGAG-3'；TNF-α forward：5'-AACTCGAGTGACAAGCCCGTAG-3'，reverse 5'-GTACCAGTTGGTTGTCTTTGA-3'；PCNA forward：5'-GGCCGAAGATAACGCGGA TAC-3'，reverse 5'-GGCATATACGTGCAAA TTCACCA-3'；CCND1 forward：5'-ATGTTC GTGGCCTCTAAGATGA-3'，reverse 5'-CAGG TTCCACTTGAGCTTGTTC-3'；Runx2forward：5'-CCCGTGGCCTTCAAGGT-3'，reverse5'-C GTTACCCGCCATGACAGTA-3'；OCNforward：5'-CCCAGGCGCTACCTGTATCAA-3'，reverse 5'-GGTCAGCCAACTCGTCACAGTC-3'；β-Actin forward：5'-TGGCACCCAGCACAATG AA-3'，reverse 5'-CTAAGTCATAGTCCGCCT AGAAGCA-3'。反应条件：95℃变性20min，95℃30s，60℃1min，40个循环。IQ5型实时荧光定量PCR仪监测记录数据，结果根据标准曲线由软件自动计算后得出。验证该方法的重复性和扩增效率。本实验进行三次重复。

1.8 Western blot检测细胞中的蛋白表达 采用细胞裂解液试剂盒分别提取常规培养条件、成骨诱导7d、SB-203580抑制后各组SHED与DPSC的总蛋白，测定蛋白样本浓度，制备蛋白样品。配置10%的分离胶、6%的浓缩胶和1×SDS电泳液，依据蛋白定量结果进行蛋白上样，电压为80V，电泳20min待溴酚蓝进入分离胶后调整电压至120V，电泳60min。随后将凝胶中的蛋白在转移电泳槽(200mA，2h)中转至聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluorid，PVDF)膜。用TBST配制的含有5%脱脂奶粉的封闭缓冲液对PVDF膜封闭2h，PVDF膜封闭一抗 p38(1∶800)、p-p38(1∶800)、ALP(1∶1000)、OCN(1∶1000)、β-Actin 为内参，4℃12h。复温1h后洗膜3次，每次5min。按说明书加入相应浓度的二抗，室温条件下封闭2h。TBST洗脱二抗，每次10min，共计3次。漂洗膜后加入电化学发光底物发光显色试剂盒显色，蛋白凝胶成像系统照相观察。

1.9 细胞周期检测 将实验组及对照组SHED和DPSC细胞消化后PBS洗两次，制备细胞悬液，调整细胞浓度为1×106/mL，PBS重悬细胞，后加入预冷的70%乙醇1.5mL吹打混匀，4℃过夜，离心弃乙醇，0.01M PBS洗2遍，加入5mol/L的碘化丙锭1mL，4℃避光染色30min，流式细胞仪(BD FACS Callibur，BD，USA)测定DNA含量，根据细胞不同的DNA含量判定细胞周期。

1.10 统计学分析 SPSS17.0统计软件进行相关数据分析。两组间比较采用独立样本t检验；P＜0.05差异有显著性。进行多组间比较时，P值进行Bonferroni校正。

2.结果

2.1 SHED和DPSC IL-1β、TNF-α分泌量及基因表达水平检测 采用Elisa方法检测SHED及DPSC IL-1β、TNF-α分泌量。结果显示SHED IL-1β含量为98.7pg/106细胞显著高于DPSC组(62.5pg/106细胞)(P＜0.05，图1A)。与之趋势一致的是SHED TNF-α含量为70.4pg/106细胞显著高于DPSC组(113.2pg/106细胞)(P＜0.05，图1A)。实时定量PCR对IL-1β、TNF-α在两组细胞中表达的检测结果与Elisa结果一致，SHED IL-1β、TNF-α分泌量显著高于 DPSC，其中SHED IL-1β表达量是DPSC的3.4倍、TNFα的表达水平是DPSCs的4.6倍(P＜0.05，图1B)。

图1 常规培养3d，SHED和DPSC细胞因子的分泌及mRNA检测

2.2 SHED和DPSC增殖及成骨分化能力检测第三代细胞进行常规培养72h后收集cDNA进行干细胞增殖能力的检测。结果显示，SHED中PCNA及CCND-1的表达水平显著高于DPSC(图2A)，将SHED和DPSC成骨诱导7d后进行ALP染色，结果可见蓝紫色着色部位，深浅程度并不均一(图2B)。采用实时定量PCR进行了成骨关键基因。结果显示：SHED和DPSC成骨诱导7d后Runx2表达水平较各自对照组均显著增高，且成骨诱导后SHED Runx2表达水平显著高于DPSC(P＜0.05)(图2C)。另一成骨关键基因OCN的表达情况与Runx2趋势一致，结果显示成骨诱导7d后OCN在SHED中的表达水平显著高于DPSC成骨诱导组(P＜0.05＝(图 2D)。

2.3 p38在SHED和DPSC成骨分化过程中的表达 将SHED和DPSC成骨诱导7d后提取了各自对照组及成骨诱导组的全细胞蛋白，WesternBlot检测p38及功能化的p-p38在细胞中的表达。结果显示p38在SHED和DPSC常规培养及成骨诱导条件下均表达，成骨诱导后p38的含量略降低。而p-p38在DPSC对照组并不表达，成骨诱导后表达量增高。p-p38在SHED成骨诱导前后均表达成骨诱导7d后其表达量增高(图3)。

图2 SHED和DPSC增殖与成骨分化潜能检测

图3 SHED和DPSC成骨诱导7d后Western Blot检测p-p38及p38蛋白检测，以β-Actin作为内参

2.4 抑制p38 MAPK对SHED和DPSC增殖及成骨分化能力的影响 加入10μmol/L特异性p38 MAPK抑制剂SB203580 60min[8]后收集SHED和DPSC全细胞蛋白Western Blot结果显示SB203580可显著抑制功能化的p-p38(图4)。在SB203580抑制SHED和DPSC 60min后P更换为常规培养液，继续培养4d后检测细胞周期。结果显示SHED对照组G1G0期细胞比例为34.57%，G2M期为7.23%，S期为58.2%；SHED SB203580干预组G1G0期细胞比例为75.7%，G2M期为0.08%，S期为24.22%；DPSC对照组G1G0期细胞比例为45.9%，G2M期为0.89%，S期为53.22%；DPSC SB203580干预组G1G0期细胞比例为85.24%，G2M期为2.0%，S期为12.76%(图5A)。随后采用Western Blot检测在SB203580抑制SHED和DPSC60min后成骨诱导7d后，结果显示抑制p38 MAPK可抑制SHED和DPSC OCN及ALP的表达(图 5B)。

图4 p38 MAPK抑制剂SB203580干扰60min后两种细胞p38MAPK表达

图5 A：SB203580干扰SHED和DPSC后流式细胞仪检测细胞周期

3.讨论

乳牙牙髓干细胞起源于神经嵴，存在于牙髓血管周围，在儿童及青少年脱落的乳牙中含有丰富的SHED，最近的研究表明：SHED具有多向分化潜能，可治疗包括系统性红斑狼疮缺血性脑损伤脊髓损伤和肌萎缩等动物模型的疾病，相比其他干细胞具有更强的自我更新性能，表现为克隆形成多、生长稳定、增殖快速等特点[9-12]。除了组织再生潜能外，SHED还具有优越的免疫调节性能。SHED的临床应用前景非常广泛，但其具体的成骨作用机制仍不明确。鉴于此本研究选择青年患者的DPSC作为对照细胞，将其生物学性能与SHED进行相应对比。

我们的研究结果显示SHED的IL-1β、TNF-α分泌量及基因表达水平均显著高于DPSC，这与Silva Fde S13的研究结果一致。IL-1β、TNF-α在SHED中有较高的分泌量及基因表达量这提示SHED与免疫调节密切相关，其免疫学性能及干细胞分化性能均优于牙髓间充质干细胞。在干细胞功能方面本研究进行了干细胞的增殖潜能及成骨分化潜能两个方面的检测。优良的种子细胞需具备较好的干细胞自我更新能力，干细胞的增殖是自我更新的一个重要指标。因此我们检测了细胞增殖中的关键基因PCNA及CCND-1二者均是检测细胞周期的重要指标，我们的研究结果显示SHED较DPSC有更优异的细胞增殖能力。随后我们采用ALP染色及实时定量PCR技术检测了其成骨分化能力。结果表明其成骨分化能力同样优于DPSC。这与前期的研究报道结果一致[3]，上述结果表明SHED具备优异的干细胞性能。在干细胞的成骨分化过程中多种分子信号通路同时发挥调控作用，明确其成骨分化的机理更有益于SHED作为种子细胞的临床应用。

MAPK是一组可以被多种细胞外信号激活的蛋白丝氨酸-苏氨酸激酶，处于胞浆信号转导通路的终末位置，主要参与生长因子、激素、细胞因子、应激等多种刺激下的细胞反应以及细胞的生长分化。目前，MAPK家族有五大类成员，分别为细胞外信号调节激酶(Extracellular-signal regulated protein kinase，ERK)1/2、c-Jun氨基末端激酶(JNK)/应激激活蛋白激酶(Stress-activated protein kinase，SAPK)、p38 MAPK、ERK5/BMK1(big MAP kinase 1)和ERK3/4等[14]。其信号传导途径在间充质干细胞向成骨细胞的增殖分化中有着重要的作用。p38MAPK的特异性抑制剂SB203580属于腑睫异咪咕哇化合物。SB203580并不阻断上游激酶对p38MAPK的激活，而是作用于p38MAPK本身。SB203580是一种可透过细胞膜的p38MAPK特异性抑制剂，其通过与ATP竞争性结合p38MAPK激酶的核酸结合位点而抑制p38MAPK激酶对其底物的磷酸化[8]。我们的研究表明SHED中p38MAPK的表达水平显著高于DPSC，这可能是由于SHED中分泌及表达的炎症因子升高所致。前期有研究表明p38MAPK与干细胞的炎症状态密切相关，一定剂量的LPS或者INF-γ均可激活细胞内的p38MAPK[15,16]。而另一方面p38MAPK又参与细胞的成骨分化这也是SHED成骨分化能力增强的一个关键原因。本研究验证了SB203580可高效的抑制p38MAPK。在p38MAPK信号被阻断后，流式细胞仪检测的细胞周期结果表明无论SHED还是DPSC其增殖指数都相应下降，这提示干细胞的增殖能力受到一定的抑制。与此同时我们观察到OCN及ALP的表达水平均下调。从干细胞增殖及成骨分化两方面的结果来看p38MAPK可使间充质干细胞的生物学性能降低，尤其对SHED的成骨分化能力有很大影响。

SHED具有广泛便捷的组织来源及优秀的干细胞生物学性能，使其成为口腔颌面部骨组织再生中极具应用前景的干细胞源。更值得关注的是：2015年7月，我国首家GMP级乳牙干细胞库在世界口腔干细胞之父施松涛教授努力下落户北京，这为SHED应用提供了基础并拓宽的应用空间。本研究以SHED作为种子细胞研究MAPK信号通路在其成骨分化过程中的作用，为SHED的临床应用提供了一定的研究基础。