正交法筛选超声提取银杏果中黄酮及多糖的工艺

苏晓丹，李延霞，艾 琰，张 莉*，黄建军*

（山东大学威海校区，海洋学院药学专业·山东威海·264209）

银杏果，又名白果，系银杏科植物银杏（Ginkgo biloba L.）的干燥成熟种子，《中华本草》中记载银杏果具有敛肺定喘，止带浊，缩小便的作用。现代药理学研究又发现银杏果对肥胖具有缓解作用[1]，还有抑制癌细胞扩散的作用，并且在抗自由基、抗血栓、改善微循环[2]等方面具有显著作用，因此在心脑血管疾病、老年痴呆、精神分裂症等方面有独特疗效。

银杏果中的有效成分是其药理作用和临床应用的物质基础，银杏种子中化学成分主要含有黄酮类、萜类、生物碱、多糖、氨基酸、蛋白质和微量元素等，还含有氢化白果酸、银杏内酯等成分[3]。除此之外，银杏中还含有具有一定毒性的白果酸、氢化白果酸等物质，必须经过加热处理除去这类物质方能食用。

近年来，国内外对银杏叶提取物尤其是银杏黄酮的研究较多，银杏果方面的研究较少，使得银杏果资源得不到重视，而我国2015年全国银杏果总产量已超过18000吨，银杏果有效成分的提取仍为当今时代一大热点问题。本实验采用正交实验法对黄酮和多糖进行优化提取，为银杏果的开发利用奠定基础。

1 材料与仪器

1.1 原料

干燥银杏果。

1.2 试剂

浓硫酸（H2SO4，AR）；苯酚（C6H5OH，AR）；葡萄糖（C6H1206·H2O，AR)； 芦丁 （C27H30O16，AR）；三氯化铝（AlCl3·6H2O，AR）；乙酸钾（C2H3O2K，AR）。

1.3 仪器

超声波清洗器（SK8210LHC，上海科导超声仪器有限公司）；低速离心机（SC3610，科大创新股份有限公司中佳分公司）；752型紫外可见分光光度计（上海光谱仪器有限公司）；电热恒温水浴锅，分析天平，称量瓶，容量瓶，烧杯，胶头滴管，洗耳球，移液管，20目药典筛。

2 实验方法

2.1 多糖含量测定方法

2.1.1 溶液的配制

葡萄糖标准液（0.1 mg/mL）的配制：精密称取10 mg葡萄糖，用纯水溶解，定容至100 mL，置于4℃冰箱中保存备用。

5%苯酚溶液（w/v）的配制：准确称取5.0 g苯酚固体，溶于纯水中，水浴加热至65℃辅助溶解，100 mL容量瓶定容，注意避光密闭保存。

2.1.2 标准曲线的绘制

精密量取葡萄糖标准储备液0.0（校正液）、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL，各以水补至 2 mL，再加入1.0 mL质量分数为5%苯酚溶液，摇匀，使其充分反应，再加入5.0 mL浓硫酸，静置10 min后再次摇匀，室温下放置20 min后，在490 nm处测定吸光度，每组平行测定三次[4]。以葡萄糖质量浓度(mg/mL)为横坐标，吸光度平均值为纵坐标，绘制标准曲线。

2.1.3 多糖含量测定

取5 mL提取液稀释定容于 100 mL容量瓶中，准确称取 1 mL多糖待测液，加入 1 mL纯水，再加入5%的苯酚溶液1.0mL，先摇匀，再加入5.0 mL浓硫酸，静置 10 min，再次摇勻，室温下放置 20 min，于490 nm处测定吸光度，将其代入回归方程，计算待测液中多糖浓度。

2.2 黄酮含量测定方法

2.2.1 溶液的配制

0.2 mg/mL芦丁标准液：精密称取0.0200 g芦丁，加入70%甲醇80℃水浴辅助溶解，定容到100 mL容量瓶中。

0.1 mol/L AlCl3溶液：准确称取 AlCl3·6 H2O 固体2.4 g，用蒸馏水溶解，100 mL容量瓶定容。

1 mol/L乙酸钾溶液：准确称取乙酸钾固体9.8g，溶于蒸馏水中，100 mL容量瓶定容。

2.2.2 标准曲线的绘制

精确移取0.2 mg/mL芦丁标准液0.00（校正液）、0.25、0.50、1.00、2.00、3.00、4.00 mL 分别 置 于 10 mL容量瓶中；加入0.1 mol/L AlCl3溶液2 mL、1 mol/L乙酸钾溶液3 mL，用体积分数70%甲醇定容至10 mL，室温放置30 min。在波长420 nm处测定溶液吸光度。每组平行测定三次[5～7]。

以芦丁质量浓度(mg/mL)为横坐标，以吸光度平均值( )为纵坐标，绘制黄酮标准曲线。

2.2.3 样品含量的测定

精确移取1 mL提取液，加入0.1 mol/L AlCl3溶液2 mL、1 mol/L乙酸钾溶液3 mL，用体积分数70%甲醇定容至10 mL，摇匀，室温放置30 min。测定420 nm处吸光度，将其代入标准曲线方程，计算提取液中黄酮浓度。

2.3 提取工艺流程

银杏果去皮磨粉→过筛→称取一定质量银杏果粉→水浴加热→超声预热→超声提取一定时间→3000 r/min，10min离心→上清液→混匀→按上述步骤测定吸光度[4，8]

2.4 提取率的计算

根据所测吸光度，计算相应提取液中多糖及黄酮的含量，按下列公式计算提取率：

总提取率=多糖提取率+黄酮提取率

2.5 单因素实验

选取料液比、温度、超声时间三个主要因素，分别设计对应水平的单因素实验。

2.5.1 料液比

固定超声温度为40℃，超声时间为20 min，选取料液比分别为 1∶10，1∶20，1∶30，1∶40、1∶50 各平行提取三次，测定吸光度并计算提取率平均值。

2.5.2 超声温度

固定料液比为1∶20，超声时间为20 min，选取超声温度分别为30℃，40℃，50℃，60℃各平行提取三次，测定吸光度并计算提取率平均值。

2.5.3 超声时间

固定料液比为1：20，超声温度为40℃，选取超声时间分别为 10，20，30，40，50 min 各平行提取三次，测定吸光度并计算提取率平均值。

2.6 正交实验

综合单因素实验结果，选取A=料液比、B=超声温度、C=超声时间三个因素设立3因素3水平的正交实验（各因素间无交互作用）[9～11]。

表1 正交实验因子水平

3 结果与分析

3.1 标准曲线

3.1.1 多糖标准曲线

以葡萄糖质量浓度(mg/mL)为横坐标，吸光度平均值为纵坐标，绘制标准曲线。拟得标准曲线方程为y=13.857x-0.0399，R2=0.9999.

3.1.2 黄酮标准曲线

以芦丁质量浓度(mg/mL)为横坐标，以吸光度平均值为纵坐标，绘制黄酮标准曲线。拟得标准曲线方程为 y=13.865x-0.0025，R2=0.9999.

3.2 单因素实验结果

3.2.1 料液比

离心后取上清液按标准曲线步骤分别测定吸光度值，平行测定三次取平均值，计算提取率，绘制料液比对提取率的影响图如下。由图像易知：多糖和黄酮的提取率均呈先增后减的趋势，分析原因应是在达到最佳料液比之前时，溶剂越多，所能容纳物质越多，越有利于多糖和黄酮的析出，但溶剂过多时，会造成杂质析出增多，干扰物质含量的测定。在其他因素确定的情况下，多糖提取的最佳料液比为1∶30，黄酮提取的最佳料液比为1∶40由于黄酮量远远小于多糖提取量，故总提取率的最佳料液比主要受多糖影响，同为1∶30。

图1 料液比对多糖提取率的影响

图2 料液比对黄酮提取率的影响

图3 料液比对总提取率的影响

3.2.2 超声温度

离心后取上清液按标准曲线步骤测定吸光度值，平行测定三次取平均值，计算提取率，绘制超声温度对提取率的影响图如下。在一定温度范围内，温度越高，提取率越高；当达到最佳温度后，提取率随温度的升高而降低。黄酮和多糖的最佳温度均为40℃，总提取率的最佳温度也为40℃。分析原因：低于40℃时，随温度升高破壁率升高，但温度过高时，一方面杂质析出增多，导致测得提取率下降；另外在超声波的作用下，可能会造成物质空间构型的改变失活，导致提取率下降。

图4 超声温度对多糖提取率的影响

图5 超声温度对黄酮提取率的影响

图6 超声温度对总提取率的影响

3.2.3 超声时间

离心后取上清液按标准曲线步骤测定吸光度值，平行测定三次取平均值，计算提取率，绘制超声时间对提取率的影响如下。由图易知：在20 min之前多糖提取率呈上升趋势，而超过20 min后提取率呈下降趋势，最佳提取时间即为20 min；黄酮的最佳提取时间为30 min；总的最佳提取时间为20 min。提取时间越长，细胞壁破碎越完全，但超声时间过长时，同样可能会导致空间构型的改变、杂质的溶出，提取率下降。

图7 超声时间对多糖提取率的影响

图8 超声时间对黄酮提取率的影响

3.3 正交实验结果

图9 超声时间对总提取率的影响

表2 正交实验表L9（33）

表3 方差分析

由正交试验结果可知，各因素对总提取率的影响按大小次序依次为A（料液比）＞C（超声时间）＞B（超声温度），各因素均无显著性差异；最优实验方案应为A2C3B2，即：

A2：料液比，第 2 水平，1：30

C3：超声时间，第 3 水平，30 min

B2：超声温度，第 2 水平，40℃

对应为实验5，提取率也为9次实验中最高，说明我们找出的最优方案符合实际。

4 结果

本次实验采用硫酸-苯酚法和三氯化铝显色法分别测定银杏果提取液中多糖和黄酮含量，最终确定银杏果多糖和黄酮的超声波辅助提取法的最佳条件为：料液比：1：30，超声时间：30 min，温度：40 ℃，总提取率可达12.27%.其中各因素对总提取率的影响按大小次序依次为料液比＞超声时间＞超声温度。

5 讨论与展望

在实验中，由于溶剂为水以及黄酮与多糖分子量差距较大，总提取率与多糖提取率十分相近。可根据待测性质重新构建总提取率的模型，例如添加系数等，使总提取率更有参考价值。

提取液中多糖和黄酮均有显著的抗氧化性，可作为抗氧化剂清除外来或内源自由基，防止其引起多不饱和脂肪酸等物质过氧化反应的物质。因此可用于预防或治疗多种ROS（活性氧簇）诱导疾病，例如癌症和各类心血管疾病，也可用于抗炎、抗衰老。除此之外，银杏种仁中还含有多种人体必需氨基酸，有助于改善健康状况，提高免疫力；还含有较多的钾、镁、钙、磷、铁、锰、铜等微量元素，对于维持人体生命活动有着极其重要的意义。据此，我们可利用提取液开发保健药品、保健食品等。此外，银杏果中还含有某些杀菌物质，可用于缓解酒糟鼻、粉刺、手足皲裂等皮肤疾病，还可以应用到护肤品中，从而更充分的利用我国现有的银杏果资源[12]。