不同甲醇流加速率对植酸酶工程菌发酵产酶的影响

王旺 李远锋 林影 梁书利

摘 要：为了确定植酸酶发酵过程中最合适的甲醇流加速率，对毕赤酵母工程菌15L罐发酵生产植酸酶的工艺条件进行了研究，通过控制3种甲醇流加速率，探讨不同甲醇流加速率條件下的毕赤酵母工程菌的植酸酶产量。

关键词：毕赤酵母;植酸酶;甲醇流加速率;发酵优化

中图分类号：TQ922 文献标识码：A 文章编号：1671-2064（2019）09-0254-03

植酸酶（EC 3.1.3.8或EC 3.1.3.26）是催化植酸及植酸盐水解成肌醇与磷酸（磷酸盐）的酶类总称，一方面它可以有效提高动物对磷的吸收利用率，提高饲料的营养价值;另一方面可减少动物粪便中磷排泄量，从而减少环境的磷污染[1]。目前，养殖业对植酸酶的需求越来越大，2010年国际植酸酶峰会报道，全球植酸酶市场占饲料酶市场60% 以上，产值3.5亿美元/年，家禽和猪饲料大约70%都添加植酸酶[2]。与此同时，植酸酶的生产成本也日益受到关注[3]。因此，提高植酸酶产量并降低其生产成本成为当前植酸酶研究和生产的重要课题。

毕赤酵母产植酸酶发酵工艺的优化已有许多相关报道。赵凯等[3，4]考察了不同比生长速率和诱导湿重对重组毕赤酵母基因工程菌Mut+发酵生产植酸酶的影响。闵兆升等[5]采用单因素试验和正交试验对毕赤酵母工程菌H311产植酸酶的发酵工艺条件进行了优化。黄魁英等[6]对耐高温植酸酶毕赤酵母工程菌PEY-2中试发酵条件进行了研究。

甲醇流加对微生物发酵影响的研究也有报道。李清亮等[7]考察了5L发酵罐中三种甲醇流加策略（恒溶氧、恒比生长速率和恒甲醇浓度）对重组毕赤酵母表达人肝再生增强因子（hALR）的影响，实验结果表明控制恒定甲醇浓度进行诱导发酵，甲醇比消耗速率和hALR表达速率显著高于其它两种流加策略。陈多等[8]依据已有毕赤酵母发酵动力学模型，设定最优化问题，利用迭代循环确定最优乘子并求解最优甲醇流加轨迹，实验证明优化后的甲醇流加方法可以使毕赤酵母表达的鼠李糖苷酶产量提高15%。王水莲等[9]考察了不同甲醇流加浓度对重组毕赤酵母发酵生产腺苷蛋氨酸（SAMe）的影响，在发酵过程中控制发酵液中甲醇浓度并测定外源蛋白表达量，实验结果表明当补加甲醇的量为0.5%时腺苷蛋氨酸表达量最高。

毕赤酵母发酵生产植酸酶的过程中，甲醇作为发酵过程中的碳源和诱导剂，其流加策略、流加速率及诱导方式都直接影响菌体的生长与外源蛋白的表达。当甲醇流加速率过低时，甲醇浓度不足，菌体的生长和外源蛋白的表达都将受到抑制，而甲醇流加速率过高则会造成菌体中毒，抑制菌体生长时[10]。目前，通过甲醇流加速率控制甲醇浓度对毕赤酵母发酵生产植酸酶方面的研究未见报道。本文研究了3.5g/（L·h）、5.5g/（L·h）、7.5g/（L·h）这3种甲醇流加速率下，毕赤酵母工程菌GAP-P180-AOX-HAC1-YNP01（简写为GAY1）的生长与产酶变化，确定了最适合毕赤酵母工程菌GAY1发酵积累植酸酶的甲醇流加速率。

1 仪器与材料

1.1 实验材料

（1）菌株。菌株为前期工作所构建的基因工程菌株GAY1（基于毕赤酵母，通过基因改造手段获得），华南理工大学酶学与酶工程实验室保种。（2）试剂。酵母粉、蛋白胨、葡萄糖、十二烷基苯磺酸钠（SDS）、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、无氨基酵母氮源YNB（含硫酸铵）、生物素、丙烯酰胺、四甲基乙二胺（TEMED）、过硫酸铵、甲醇、甘油、钒酸铵、钼酸铵、硝酸、乙酸、乙酸钠、植酸钠。（3）培养基和终止显色液。YPD种子培养基（1L）：10g酵母粉，20g蛋白胨，10g葡萄糖。

BSM发酵培养基：1.49%（W/V）七水硫酸镁，0.094%（W/V）硫酸钙，1.82%（W/V）硫酸钾，2.67%（V/V）磷酸，0.413%（W/V）氢氧化钾，4%（W/V）甘油，121℃蒸汽灭菌30min，冷却至30℃，添加0.435%（V/V）PTM1。

PTM1微量元素溶液：0.08g碘化钠，6.00g五水硫酸铜，0.02g硼酸，20.00g氯化锌，3.00g一水硫酸锰，0.20g二水钼酸钠，0.50g氯化钴，0.20g生物素，65.00g七水硫酸亚铁，1mL浓硫酸，用去离子水定容至1L，再用0.22μm孔径无菌水相滤膜过滤，4℃保藏备用。

硝酸溶液：浓硝酸与水按体积比1：2混合均匀。

终止显色液：硝酸、100g/L钼酸铵、2.35g/L钒酸铵按体积比2：1：1混合，现用现配。

1.2 方法

（1）种子培养。将保藏菌种接种到YPD平板上划线，30℃培养24h，从平板培养基上挑取酵母单克隆接种于10mL YPD液体培养基中，在30℃，250r/min条件下培养18-24h，再按照10%接种量接种YPD培养基扩培18-24h，然后按照8%接种量接入发酵罐BSM培养基中发酵培养。（2）发酵控制。甘油生长阶段流加氨水控制pH5.5，温度设定为30℃。甘油耗尽后通过流加含12mL/L微量盐（PTM1）培养基的50%的甘油增加菌浓，控制相同菌体OD600（200左右）开始诱导，根据实验需求和测量的菌浓控制不同的甲醇流加速率3.5g/（L·h）、5.5g/（L·h）、7.5g/（L·h）进行相应的甲醇补料诱导植酸酶表达。此时，流加氨水控制pH6.0，温度设定为25℃。每隔8h取样测测量。（3）分析方法。生长检测。用OD600表示菌体生长，取发酵液利用UV2350型紫外分光光度仪，在波长600nm处检测吸光值。

酶活测定。酶活测定采用钼钒酸铵法[11]。

2 结果与讨论

2.1 甲醇流加速率为3.5g/（L·h）时的发酵情况

发酵液底料中含有4%的甘油，甘油耗尽之后DO回升，此时开始流加50%的甘油直至诱导所需OD600为250（大约发酵时间30h），之后停止流加甘油，饥饿60min左右，开始流加甲醇诱导产酶。初始甲醇流加速度为1g/（L·h），每两小时提高0.5g/（L·h），直到甲醇流加速度为3.5g/（L·h）时，停止继续提高，并以该流速流加至发酵结束。该流加速度下的发酵情况如图1。

由图1可知，发酵到40h，菌体OD600达到259，开始流加甲醇诱导产酶，随后菌体OD600和酶活随发酵时间增加而增加，发酵至176h下罐時，菌体OD600达到460，植酸酶酶活达到24698U/mL。

2.2 甲醇流加速率为5.5g/（L·h）时的发酵情况

甲醇诱导产酶之前的过程同2.1。初始甲醇流加速度为1g/（L·h），每两小时提高0.5g/（L·h），直到甲醇流加速度为5.5g/（L·h）时，停止继续提高，并以该流速流加至发酵结束。该流加速度下的发酵情况如图2。

由图2可知，发酵到40h，菌体OD600达到252，开始流加甲醇诱导产酶，随后菌体OD600和酶活随发酵时间增加而增加，发酵至144h菌体OD600达到最大579，发酵至168h酶活达到最大26386U/mL，相较于甲醇流加速率3.5g/（L·h）酶活提高了6.83%，OD600提高了25.87%。发酵至176h下罐时，菌体OD600为511，酶活25864U/mL。

2.3 甲醇流加速率为7.5g/（L·h）时的发酵情况

甲醇诱导产酶之前的过程同2.1。初始甲醇流加速度为1g/（L·h），每两小时提高0.5g/（L·h），直到甲醇流加速度为7.5g/（L·h）时，停止继续提高，并以该流速流加至发酵结束。该流加速度下的发酵情况如图3。

由图3可知，发酵到40h，菌体OD600达到238，开始流加甲醇诱导产酶，随后菌体OD600和酶活随发酵时间增加而增加，发酵至152h菌体OD600达到最大578，发酵至160h酶活达到最大22108U/mL，相较于甲醇流加速率3.5g/（L·h）OD600提高了25.65%但酶活降低了10.49%，而相较于甲醇流加速率5.5g/（L·h）OD600相近，但酶活降低了16.21%。发酵至176h下罐时，菌体OD600为518，酶活21863U/mL。

综合以上分析，可以推断出甲醇流加速率3.5g/（L·h）条件下，甲醇流加量不足，菌体的生长和酶活都受到限制。甲醇流加速率7.5g/（L·h）条件下，虽然菌体生长所需的营养充足，菌体生长不再受限，但甲醇积累量偏高，抑制了植酸酶酶活。甲醇流加速率5.5g/（L·h）条件下菌体生长所需营养物质充足，植酸酶酶活也未受到影响，因此，甲醇流加速率5.5g/（L·h）最适合毕赤酵母工程菌GAY1发酵生产植酸酶。

3 结语

该试验通过控制温度、pH等，改变诱导阶段甲醇流加速率的发酵条件，探讨了毕赤酵母工程菌GAY1发酵生产植酸酶的生长与产酶规律，发现5.5g/（L·h）甲醇流加速率条件下，菌体在整个发酵过程中菌体生长和植酸酶酶活都处于更理想的状态，得出结论：甲醇流加速率5.5g/（L·h）最适合于毕赤酵母工程菌GAY1发酵生产植酸酶。该试验确定毕赤酵母工程菌发酵过程中甲醇流加速率的控制策略，建立了基因工程菌株产植酸酶能力的评价体系，对植酸酶的实际工业发酵生产具有参考价值。

参考文献

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