熟畜肉中金黄色葡萄球菌污染标记物动态变化及与菌体生长关联分析

胡凯丽,陈 娟,唐俊妮,代义闯,左子珍

(西南民族大学,四川成都 610041)

金黄色葡萄球菌在自然界中广泛存在,在空气、水、灰尘、人和动物的排泄物中都可以找到,因此金黄色葡萄球菌极易污染食物。熟肉制品因其方便美味,受到广大消费者的普遍喜爱,但是熟肉制品在加工、运输、销售的过程中往往极易受到金黄色葡萄球菌的污染,从而引发食物中毒。容冬丽等[1]对我国15个代表性城市的即食食品中金黄色葡萄球菌污染调查表明,卤肉中污染率为16.3%,烤肉为9.2%。鲁延迅等[2]报道了吉林长春市熟猪肉和熟牛肉制品中金黄色葡萄球菌污染率分别为31.1%和21.3%。Young等[3]从香港商店采集的50份烤猪肉样品中检出25份(50%)受到金黄色葡萄球菌的污染。许振伟等[4]对上海市场抽样调查发现,酱肉制品和腌腊肉制品中金黄色葡萄球菌污染率为23.1%和19.1%。可见,熟肉制品中金黄色葡萄球菌的污染率很高,对广大消费者的生命健康存在安全隐患。

一直以来,传统培养法和聚合酶链式反应技术(Polymerase chain reaction,PCR)都是常用的微生物鉴定方法。然而,传统培养法存在操作繁琐、耗时费力等缺点,PCR方法也存在假阳性率较高、食物样品前处理复杂等不足之处。随着代谢组学研究技术的逐渐成熟,寻找食源性致病微生物的特征性代谢产物及代谢产物谱已成为致病菌快速检测和鉴定研究的一个重要方向。学者们建议将食源性致病菌挥发性代谢产物分析作为临床和食品中致病菌鉴别的替代方法[5-6]。细菌挥发性代谢产物是由复杂的挥发性化学成分组成,包括各种不同化学结构和极性的挥发性化合物[7]。尽管某些种或属的细菌被发现存在着交迭的挥发性代谢产物类型,但各种或属的细菌都有着独特的代谢方式,典型的挥发性成分和挥发性特征必定是种或属特有的,可以视为鉴别的生物标志[8]。常见致病菌挥发性代谢轮廓的多元统计分析表明,金黄色葡萄球菌具有区别于其他致病菌的典型挥发性代谢特征[9-10]。在金黄色葡萄球菌胰蛋白胨大豆肉汤培养物的挥发性代谢产物中,3-甲基丁醛、3-甲基丁酸、甲硫醇和3-羟基-2-丁酮的产生量显著高于培养基中的本底值,是金黄色葡萄球菌释放的主要代谢产物[11]。Bos等[12]综合分析了大量文献得出,3-甲基丁醛和3-甲基丁酸是金黄色葡萄球菌的特征挥发性代谢产物。本课题组的前期研究也发现,金黄色葡萄球菌的胰蛋白胨大豆肉汤培养物产生了3-甲基丁醛和3-甲基丁酸,且产量显著高于其它致病菌[13]。因此,本研究将这两个化合物作为金黄色葡萄球菌的挥发性标记物。

本研究采集不同来源和部位的猪肉、牛肉和羊肉,分别调查肉中两个标记物的本底值范围;然后分别接种金黄色葡萄球菌,动态测定标记物的信号强度以及金黄色葡萄球菌的生长数量,旨在探索标记物的释放规律及与金黄色葡萄球菌生长的关联性,揭示不同类型的肉基质对金黄色葡萄球菌生长和代谢的影响,为建立基于挥发性标记物的肉中金黄色葡萄球菌快速检测技术提供基础科学数据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

金黄色葡萄球菌参考菌株StaphylococcusaureusATCC 6538 中国工业微生物菌种保藏管理中心(China Center of Industrial Culture Collection);胰蛋白胨大豆肉汤(Tryptone Soy Broth,TSB)培养基,Baird-Parker(BP)琼脂基础、亚碲酸盐卵黄增菌液 青岛高科园海博生物技术有限公司;猪精瘦肉、牛精瘦肉、羊精瘦肉(见表2～表3) 成都及周边的超市、便利店、零售肉摊和公司。

Trace DSQ型GC-MS联用仪(配置Triplus自动进样器) 美国Thermo公司;MOF-4086S低温冰箱、MLS-3020高压蒸汽灭菌锅 日本三洋公司;SW-CJ-1F超净工作台 苏州安泰空气技术有限公司;DHG-9203A电热恒温鼓风干燥箱 上海一恒科技有限公司;GHP-9280 隔水式恒温培养箱 上海齐欣科学仪器有限公司;HZQ-F160恒温振荡培养箱 太仓市实验设备厂;50/30 μm碳分子筛/二乙基苯/聚二甲基硅氧烷(carboxen/divinylbenzene/polydimethylsiloxane,DVB/CAR/PDMS)萃取头 美国Supelco公司。

1.2 实验方法

1.2.1 原料肉的预处理 将购买的猪精瘦肉、牛精瘦肉和羊精瘦肉经绞肉机绞碎后,分别称取猪肉糜、牛肉糜和羊肉糜5.00 g装入顶空瓶中,使用硅胶塞封口,经高压蒸汽灭菌(121 ℃,101 kPa,15 min)后放入干燥箱中50 ℃下干燥20 h,至瓶内肉样品无汁液,得到无菌的熟肉样品。

1.2.2 样品的制备

1.2.2.1 基质本底样品 采集不同地点和部位的猪精瘦肉20份(6份里脊肉、4份前腿肉、4份后腿肉、3份前夹肉和3份腰柳肉)、牛精瘦肉20份(5份瓜条肉、3份牛肩肉、2份牛腩肉、3份后腿肉、1份筋肉、1份背柳肉、1份里脊肉、1份前夹肉、2份前腿肉和1份腰柳肉)、羊精瘦肉20份(3份羊背肉、7份羊腿肉、2份羊臂肉、2份羊脖肉、3份羊肩肉、1份羊腹肉和1份羊排肉),经预处理后作为基质本底样品。

1.2.2.2 金黄色葡萄球菌污染样品 吸取金黄色葡萄球菌冷冻保藏菌液50 μL接种入5 mL TSB培养基中,于(37±1) ℃,200 r/min条件下培养13 h。用接种环钩取一环金黄色葡萄球菌培养液在BP平板上划线,于(37±1) ℃条件下培养(24±1) h,直到平板上长出灰黑色并带有溶菌环的典型菌落。挑取具有金黄色葡萄球菌典型特征的单菌落接入5 mL TSB培养基中,于(37±1) ℃,200 r/min条件下培养13 h。然后,将该新鲜培养物进行梯度稀释至10-7,吸取10-7菌悬液300 μL分别接入5.00 g熟猪肉糜、牛肉糜和羊肉糜中,使初始接种量达到100～200 CFU/g,于(37±1) ℃条件下静置培养24 h,每隔2 h取样测定挥发性标记物和金黄色葡萄球菌的生长数量,每个时间点做3个平行样品。以不接种金黄色葡萄球菌的肉样为空白样品,进行两次重复试验。

1.2.3 挥发性代谢产物的测定

1.2.3.1 萃取条件 采用50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头,在80 ℃预孵化10 min,萃取30 min[14]。

1.2.3.2 气相色谱分析条件 TR-FF AP色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm);不分流模式,不分流1 min之后分流比为50︰1;流速1 mL/min;升温程序:40 ℃保持3 min,以7 ℃/min 升温至220 ℃并保持2 min;载气为99.999%氦气;进样口温度230 ℃;解吸时间2 min[14]。

1.2.3.3 质谱分析条件 电子电离源,电子能量70 eV;离子源温度250 ℃;传输线温度220 ℃;选择离子流扫描模式(SIM),参数见表1。

表1 选择离子流扫描参数Table 1 Selective ion flow scan parameters

1.2.4 金黄色葡萄球菌生长数量测定 将5.00 g样品用45 mL生理盐水稀释,再经10倍梯度稀释至适宜的稀释度,采用平板菌落计数法进行金黄色葡萄球菌生长数量的测定。每个时间点做3个平行样品,进行两次重复试验。

1.3 数据处理

1.3.1 挥发性标记物响应强度 通过Thermo Xcalibur 2.2SP1.48软件报告标记物的峰面积,对于每个取样时间点,用金黄色葡萄球污染样品的峰面积值扣除肉样空白值后,再求平均值和标准偏差,用Excel 2003绘制挥发性标记物释放规律图。

1.3.2 金黄色葡萄球菌生长数量 对于每个取样时间点,金黄色葡萄球菌生长数量求平均值和标准偏差,用Excel 2003绘制细菌生长变化图。

1.3.3 金黄色葡萄球菌在不同熟畜肉中挥发性标记物释放与菌体生长相关性 采用SPSS 18.0 对培养过程中金黄色葡萄球菌的生长数量与挥发性标记物响应强度之间做Spearman相关分析,p<0.01表示差异极显著,p<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 三种熟畜肉基质本底调查结果

试验所用猪肉、牛肉和羊肉样品均采自不同来源和不同部位,样品的挥发性标记物信号强度各不相同。猪肉样品的3-甲基丁醛信号强度小于5×106counts×sec,3-甲基丁酸的信号强度与3-甲基丁醛相近,小于4×106counts×sec(见表2);牛肉样品的3-甲基丁醛信号强度小于2×107counts×sec,3-甲基丁酸的信号强度小于6×106counts×sec(见表3);羊肉样品的3-甲基丁醛信号强度小于3×107counts×sec,3-甲基丁酸的信号强度明显低于3-甲基丁醛,小于4×106counts×sec(见表4)。另外,在检测的20个牛肉和羊肉样品中有少数几个样品的3-甲基丁醛信号强度高于107counts×sec,而在检测的所有猪肉样品中3-甲基丁醛信号强度均小于107counts×sec。

表2 熟猪肉中标记物本底调查结果Table 2 Survey results of the signal intensities of volatile markers from cooked pork

表3 熟牛肉中标记物本底调查结果Table 3 Survey results of the signal intensities of volatile markers from cooked beef

表4 熟羊肉中标记物本底值的调查结果Table 4 Survey results of the signal intensities of volatile markers from cooked mutton

2.2 金黄色葡萄球菌在不同畜肉基质中挥发性标记物释放与菌体生长情况

2.2.1 熟猪肉中金黄色葡萄球菌挥发性标记物释放与菌体生长情况 试验所用猪肉空白样品的3-甲基丁醛信号强度是1.76×105counts×sec,3-甲基丁酸信号强度是2.56×105counts×sec,在表2猪肉本底值范围以内。由图1可知,金黄色葡萄球菌在熟猪肉上生长时,37 ℃培养至12 h时3-甲基丁醛出现首次显著增长(p<0.05),到18 h时,3-甲基丁醛的累积强度达到最大值(2.22×107counts×sec),18～24 h,3-甲基丁醛的强度迅速降低至0。3-甲基丁酸信号培养至14 h时出现首次显著增长(p<0.05),之后逐渐上升,直至24 h达到2.48×107counts×sec。在整个培养过程中,3-甲基丁醛的信号检测时间略早于3-甲基丁酸,3-甲基丁醛的信号强度增至最大值后迅速下降至0,而3-甲基丁酸的信号强度呈持续增长趋势。由图2可知,在熟猪肉上,37 ℃下金黄色葡萄球菌的对数生长期约在2～14 h之间,之后进入稳定期,最终菌体生长量可以达到1.75×109CFU/g。

图1 熟猪肉中金黄色葡萄球菌挥发性标记物的释放规律

图2 熟猪肉中金黄色葡萄球菌的生长情况

2.2.2 熟牛肉中金黄色葡萄球菌挥发性标记物释放与菌体生长情况 试验所用牛肉空白样品的3-甲基丁醛信号强度是2.75×106counts×sec,3-甲基丁酸信号强度是2.95×105counts×sec,在表3牛肉本底值范围以内。由图3可知,金黄色葡萄球菌在熟牛肉上生长时,37 ℃培养至12 h时,3-甲基丁醛出现首次显著增长(p<0.05),到18 h时3-甲基丁醛的累积强度达到最大值(4.48×107counts×sec),从18 h到24 h,3-甲基丁醛的强度迅速降低至0。3-甲基丁酸的信号培养至14 h时出现首次显著增长(p<0.05),之后逐渐上升,直至24 h达到3.27×107counts×sec。在整个培养过程中,3-甲基丁醛的信号检测时间略早于3-甲基丁酸,3-甲基丁醛的信号强度增至最大值后迅速下降至0,而3-甲基丁酸的信号强度呈持续增长趋势。由图4可知,在熟牛肉上,金黄色葡萄球菌的对数生长期约在2～16 h之间,之后进入稳定期,最终菌体生长量可以达到1.96×109CFU/g。

图3 熟牛肉中金黄色葡萄球菌挥发性标记物的释放规律

图4 熟牛肉中金黄色葡萄球菌的菌体生长情况

2.2.3 熟羊肉中金黄色葡萄球菌挥发性标记物释放与菌体生长情况 试验所用羊肉空白样品的3-甲基丁醛信号强度是3.85×106counts×sec,3-甲基丁酸信号强度是6.74×105counts×sec,在表4羊肉本底值范围以内。由图5可知,金黄色葡萄球菌在熟羊肉上生长时,37 ℃培养至12 h时,3-甲基丁醛出现首次显著增长(p<0.05),到18 h时,3-甲基丁醛的累积强度达到最大值(8.05×107counts×sec),从18 h到24 h,3-甲基丁醛的强度迅速降低至0。3-甲基丁酸的信号培养至14 h时,出现首次显著增长(p<0.05),之后逐渐上升,直至24 h达到6.33×107counts×sec。在培养过程中,3-甲基丁醛的信号检测时间早于3-甲基丁酸,3-甲基丁醛的信号强度增至最大值后迅速下降至0,而3-甲基丁酸的信号强度在24 h内持续增长。由图6可知,在熟羊肉上,金黄色葡萄球菌的对数生长期约在2～14 h之间,之后进入稳定期,最终菌体生长量可以达到2.84×109CFU/g。

图5 熟羊肉中金黄色葡萄球菌挥发性标记物的释放规律

图6 熟羊肉中金黄色葡萄球菌生长情况

2.2.4 挥发性标记物出现首次显著增长对应的金黄色葡萄球菌生长水平分析 由图1～图6可知，在熟猪肉中,3-甲基丁醛首次显著(p<0.05)增长对应的金黄色葡萄球菌生长数量为2.68×107CFU/g,3-甲基丁酸首次显著增长对应的金黄色葡萄球菌生长数量为7.35×107CFU/g。在熟牛肉中,金黄色葡萄球菌生长至1.67×107CFU/g时,3-甲基丁醛出现首次增长,金黄色葡萄球菌菌体达到1.85×108CFU/g时,3-甲基丁酸出现首次增长。在熟羊肉中,3-甲基丁醛首次显著增长对应的金黄色葡萄球菌生长数量为1.25×107CFU/g,3-甲基丁酸首次显著(p<0.05)增长对应的金黄色葡萄球菌生长数量为8.65×107CFU/g。可见,当金黄色葡萄球菌生长达到107CFU/g时3-甲基丁醛信号可被明显检出,而3-甲基丁酸信号则需要金黄色葡萄球菌生长量接近108CFU/g时才可被明显检测到。

2.3 金黄色葡萄球菌在不同熟畜肉中挥发性标记物释放与菌体生长相关分析

鉴于金黄色葡萄球菌在熟猪肉、熟牛肉和熟羊肉中培养18 h之后,3-甲基丁醛的信号强度均显著降低(p<0.05),针对0～18 h培养过程,检测到3-甲基丁醛的信号强度与细菌菌体生长数量之间均呈极显著相关(p<0.01,见表5)。在0～24 h整个培养过程中,检测到3-甲基丁酸的信号强度与细菌菌体生长数量之间均呈极显著相关(p<0.01,见表5)。

表5 三种熟肉中金黄色葡萄球菌挥发性 标记物与菌体生长的Spearman相关系数Table 5 Spearman correlation coefficients of volatile markers and bacterial growth on three cooked meats

3 讨论

徐薇薇等[15]报道了3-甲基丁醛是宁夏滩羊后腿肉的关键风味成分之一。Takakura等[16]采用二乙醚萃取结合气相色谱质谱分析牛肉的风味物质,得到3-甲基丁酸是对牛肉风味有积极贡献的香味活性化合物。Inagaki等[17]分析了日本神户牛肉和澳洲牛肉的风味特征,从两种牛肉样品中均检出3-甲基丁酸。再者,不同的烹饪条件包括加热温度和加热时间等都会影响到肉质化学反应的类型和程度,进而直接影响风味物质的形成。Pulgar等[18]发现,在真空低温烹调猪肉时,与60 ℃相比,80 ℃烹饪的猪肉样品被检出更高含量的3-甲基丁醛,进而推测加热温度越高越利于氨基酸的降解反应产生更高含量的3-甲基丁醛。张迪雅等[19]也得出,与60 ℃加热相比,120 ℃加热的牛肉中3-甲基丁醛明显增多。3-甲基丁醛是亮氨酸的Strecker降解产物,3-甲基丁醛进一步氧化则形成3-甲基丁酸。本实验中采用的猪肉、牛肉和羊肉样品都是经过高压灭菌处理(121 ℃,101 kPa,15 min),从三种肉样中检出一定强度的3-甲基丁醛和3-甲基丁酸,提示在建立基于挥发性标记物检测肉中金黄色葡萄球菌方法时首先要考虑肉的本底值情况。

本研究结果得出,3-甲基丁醛和3-甲基丁酸出现首次显著(p<0.05)增长对应的金黄色葡萄球菌生长量分别约为107和108CFU/g。同样,在Filipiak等[11]的研究中也指出,金黄色葡萄球菌在TSB中培养时,菌体生长量分别达到7×106和5×107CFU/mL时3-甲基丁醛和3-甲基丁酸才出现首次显著增长。Hettinga等[20]研究也表明,在牛乳中,金黄色葡萄球菌的生长达到107CFU/mL时其典型的挥发性代谢产物才会积累达到可检测水平。这说明,只有当金黄色葡萄球菌的生长水平达到某个阈值时,挥发性代谢产物才会出现明显增长。对于其他微生物而言,挥发性代谢产物释放特征也有相似报道[21]。研究已证实,食物中金黄色葡萄球菌数量高于105CFU/(g或mL)是肠毒素产生的必要条件,肠毒素是引发葡萄球菌食物中毒的主要原因[22]。因此,推测3-甲基丁醛和3-甲基丁酸在作为金黄色葡萄球菌污染食物的标记物的同时,该两个标记物的检出还可以指示食物的不安全状态。

随着当前检测技术手段和统计分析方法的不断完善,气味指纹技术和气味标记物技术在肉品品质及安全检测中具有广阔的应用前景[23]。该技术具有敏感、快速、样品用量少、操作简单、不采用溶剂等优势,满足肉品安全的在线检测需要。金伟平等[24]采用顶空固相微萃取-气质联用法分析了单核细胞增生李斯特菌污染冷藏牛肉的挥发性物质,找出了可以表征冷藏牛肉被单增李斯特菌污染的特征性气味物质。Xu等[25-26]对自然污染和人工污染鼠伤寒沙门氏杆菌的猪肉进行了挥发性和非挥发性代谢物质分析,不仅采用多元统计分析能将两类样品区分开,还鉴定出了准确区分两类样品的17个非挥发性代谢产物和16个挥发性代谢产物。这些研究报道说明,肉品营养丰富,易受微生物污染,其次级代谢产物会产生特定的挥发性气味物质,基于这点可以利用气味技术检测肉中的微生物。然而,目前未见金黄色葡萄球菌污染肉的气味检测技术报道。在前期研究基础上,本研究以3-甲基丁醛和3-甲基丁酸为金黄色葡萄球菌的挥发性标记物,发现在不同类型的畜肉中金黄色葡萄球菌标记物释放与细菌生长均呈现良好的相关性,说明畜肉的类型不会影响标记物释放与菌体生长的关联,为建立基于挥发性标记物的金黄色葡萄球菌生长预测模型提供基础数据。

4 结论

从熟猪肉、牛肉和羊肉基质中均检出一定强度的挥发性标记物(3-甲基丁醛和3-甲基丁酸),检测值只有明显高于此本底值时,才可判定肉中存在金黄色葡萄球菌污染。金黄色葡萄球菌在畜肉中生长时,菌体生长量分别达到107、108CFU/g 时才能明显检测到3-甲基丁醛和3-甲基丁酸信号的增长,分别在0～18 h和0～24 h 培养期间,3-甲基丁醛和3-甲基丁酸释放与菌体生长极显著相关(p<0.01)。