胀桶番茄酱中腐败微生物的分离及鉴定

李 慧,李 赫,陈历水,*,欧静堃,刘 蕾,史玉莹,张连慧

(1.中粮营养健康研究院,北京 102209;2.老年营养食品研究北京市工程实验室,北京 102209;3.北京工商大学，北京食品营养与人类健康高精尖创新中心,北京 100048)

番茄营养丰富、风味独特,具有独特的保健功效,是餐桌上常见的蔬菜之一。因番茄的保质期短,通常加工成番茄酱、番茄汁等制品以延长储藏时间[1]。番茄酱是由成熟红番茄经去皮、破碎、去籽等粗硬物质打浆后,再经浓缩、装罐、杀菌而制成,是国内外餐桌上不可缺少的佐餐食品原料,其品质直接影响经济效益[2]。

番茄酱加工工艺成熟,按照严格的工艺要求和贮藏条件能够达到2年保质期,但是工厂为了降低贮藏、运输和包装成本,外包装多采用钢桶、木箱等形式,贮藏方式多为露天存放,以苫盖篷布防护为主。在此过程中,番茄酱很容易在保质期内出现胀桶、漏酱、瘪桶等问题,使产品变质。针对这些变质问题,国内外学者一直开展相关研究,为持续解决这一行业难题提供解决方案。杨红红等[3]从番茄酱中分离纯化了芽孢杆菌、大肠埃希氏杆菌、棒杆菌、酵母菌及霉菌,并证明芽孢杆菌是引起番茄酱变质的主要腐败菌。黄玲等[4]从胀袋番茄酱中分离出季也蒙假丝酵母和丛生丝孢酵母。Vercammen等[5]研究发现,肉毒梭状芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、酸土脂环酸芽孢杆菌是热加工酸性食品的主要腐败菌。因此,不同的胀气番茄酱产品,应进行针对性分析,确定引起番茄酱产气变质的主要原因,以提供更科学的解决方案。

本研究针对露天储存的大桶番茄酱产品在38 ℃以上高温条件下存在轻微产气胀桶的问题,通过微生物分离纯化及鉴定,以确认引起本研究大桶番茄酱胀气的腐败微生物类型,为番茄酱生产企业有效控制或者降低大桶番茄酱变质损失,保障番茄酱的质量与安全提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

金属桶装大罐番茄酱 新疆某番茄制品有限公司露天存放已有胀气现象,每桶体积为100 kg;溴甲酚紫葡萄糖琼脂培养基、疱肉琼脂培养基、酸性肉汤培养基、麦芽浸膏(琼脂)培养基、营养肉汤(琼脂)培养基、MRS(琼脂)培养基、琼脂、酵母粉、蛋白胨 北京陆桥技术有限责任公司;葡萄糖 分析纯,国药集团化学试剂有限公司;细菌基因组DNA提取试剂盒(DP302)、酵母基因组脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA)提取试剂盒(DP307)、聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)产物纯化试剂盒 天根生化科技有限公司;脱氧核糖核苷三磷酸(deoxy-ribonucleoside triphosphate,dNTP)、Taq酶(5 U/μL)、Buffer 宝生物工程(大连)有限公司;引物 英捷潍基上海贸易有限公司合成;API 50 CHB/20 E试剂条 法国梅里埃公司。

IPP260低温培养箱 德国Memmert公司;超净工作台 新加坡ESCO公司;生物安全柜 美国LABCONCO公司;ATBTMNew ATB自动微生物鉴定系统 法国梅里埃公司;Scan1200自动菌落计数仪、400VW拍击式均质器 法国Interscience公司;Scope A1正置相差显微镜 德国ZEISS公司;SQ510C立式压力蒸汽灭菌器 日本YAMATO公司;Mini Bead beater-16 磨珠均质器 美国Biospec公司;Veriti梯度PCR仪 美国Lifetechnologies公司;NanoDrop 2000超微量分光光度计 美国Thermo Fisher公司;XR System凝胶成像系统 美国Bio-Rad公司。

1.2 实验方法

1.2.1 污染菌种的分离和纯化 从胀桶番茄酱中选取颜色异常的样品25 g,置于盛有225 mL磷酸盐缓冲液的无菌均质袋中,利用拍击式均质器拍打1～2 min,制成1∶10 (v/v)的样品匀液,然后将此样品进行10倍梯度稀释至10-6备用。

取各梯度稀释样品匀液1 mL置于无菌平皿中,每个稀释度4个平皿。后将15～20 mL冷却至46 ℃的溴甲酚紫葡萄糖琼脂培养基、疱肉琼脂培养基、酸性肉汤琼脂培养基倾注平皿,并转动平皿使其混合均匀冷却。待琼脂凝固后,将平板翻转。取各培养基的2块平板(其中1块平板在厌氧盒中),分别置于36、55 ℃恒温培养箱中,培养3～5 d,均用于分离嗜中温微生物和嗜热微生物。

另取各梯度稀释样品匀液1 mL置于无菌平皿中,每个稀释度做2个平皿。后将15～20 mL冷却至46 ℃的麦芽浸膏琼脂培养基、营养琼脂培养基、MRS培养基倾注平皿,并转动平皿使其混合均匀。待琼脂凝固后,将平板翻转,麦芽浸膏琼脂培养基平板于28 ℃恒温培养箱中培养3～5 d,用于分离真菌;营养琼脂培养基、MRS培养基平板(其中一块平板在厌氧盒中)置于36 ℃恒温培养箱,培养2～3 d,用于分离其他腐败微生物及乳酸菌类微生物。

根据菌落生长形态、大小及颜色的不同,挑选不同的单菌落接种于相应的固体培养基中进行纯化,直至得到单一菌落。

1.2.2 形态学观察 将纯化得到的细菌在相对应的分离固体培养基上划线,36 ℃培养24～48 h后观察菌落生长情况、菌落形态并镜检。将分离得到的真菌在麦汁琼脂培养基上进行划线,于28 ℃条件下培养3～5 d后观察菌落生长情况、菌落形态并镜检。

1.2.3 分子生物学鉴定

1.2.3.1 细菌的分子生物学鉴定 挑取细菌平板上的单菌落分别接种营养肉汤培养基中,37 ℃过夜。取1 mL菌液12000 r/min离心10 min后,弃去上清,按照细菌基因组DNA提取试剂盒提取基因组的说明书规定操作,所得的基因组用超微量紫外分光光度计检测浓度和纯度。

16S rDNA序列扩增所用引物,正向引物为27F:5′-AGAGCCTGGCTCAGTTTGAT-3′反向引物为1492R:5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′[6-8]。

PCR反应体系:30 μL反应体系,依次加入无酶无菌水19.2 μL、10×Buffer 3 μL、dNTPs 2.5 μL、正、反向引物各1.5 μL、Taq酶0.3 μL(5 U/μL)、所提取的基因组2 μL。PCR反应条件:95 ℃预变性10 min,进入循环程序,95 ℃变性30 s,58 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,35个循环,再72 ℃延伸10 min,4 ℃条件下暂时保存,-20 ℃条件下保存备用。PCR完成后将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。

将电泳检测后的PCR产物送至英潍捷基上海贸易有限公司进行测序,获得16S rDNA基因序列。测序结果在NCBI的GenBank中进行BLAST分析比对,并进行同源序列搜索,根据同源序列搜索结果,导出同源性达99%以上相关模式菌株的16S rDNA基因序列区构建系统发育树。

1.2.3.2 真菌分子生物学鉴定 挑取麦汁平板上的单菌落于YPD培养基中,在28 ℃恒温摇床中200 r/min振荡培养15 h。12000 r/min离心10 min后,弃去上清,按照酵母基因组DNA提取试剂盒提取基因组的说明书规定操作,所得的基因组用超微量紫外分光光度计检测浓度和纯度。

ITS区域扩增所用引物对参照李慧等[9]、Chen等[10]的研究,ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和 ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′),PCR反应体系同方法1.2.3.1,PCR反应条件为:95 ℃预变性5 min,进入循环程序,95 ℃变性1 min,52 ℃退火2 min,72 ℃延伸1 min,循环35次,72 ℃延伸10 min,4 ℃条件下暂时保存,-20 ℃条件下保存备用。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测后送至英潍捷基上海贸易有限公司进行测序,获得ITS基因序列。测序结果在NCBI的GenBank中进行BLAST分析比对,并进行同源序列搜索,根据同源序列搜索结果,导出同源性达99%以上相关模式菌株的ITS基因序列区构建系统发育树。

1.2.4 细菌生化鉴定 挑取培养的单菌落,使用法国生物梅里埃公司API 50 CHB/20 E试剂条进行鉴定。

1.3 数据处理

使用MEGA 6.0软件对分离、纯化腐败微生物的分子序列测序结果构建进化树。

2 结果与分析

2.1 细菌的鉴定

2.1.1 细菌的菌落形态及镜检结果 通过对番茄酱中的细菌进行分离、简单形态学分析后得到4株不同形态的细菌,依次编号为B001、B002、B003和B004。将菌株B001、B002、B003和B004在营养琼脂培养基上划线,(36±1) ℃培养48 h后观察。

如图1菌株B001菌落直径3 mm左右,表面光滑,边缘整齐,不透明,奶油状,有芽孢,芽孢中生,椭圆形;菌株B002菌落直径5～7 mm,边缘不整齐,菌落白色,有芽孢,芽孢中生,椭圆形;菌株B003菌落直径3～5 mm,圆形或近似圆形、边缘不规则,菌落略带黄色,有芽孢,芽孢中生;菌株B004菌落直径5～7 mm,圆形或近似圆形,白色菌落,有芽孢,芽孢端生。

图1 细菌的菌落形态及镜检结果(1000×)

2.1.2 细菌16S rDNA基因序列同源性比对与系统发育分析 将菌株B001、B002、B003、B004的扩增基因序列与GenBank内已知菌株的相应序列进行比对,通过同源性比对结果构建系统发育进化树。以16S rDNA基因序列为分子标记的4株细菌系统发育树,如图2所示。菌株B001与Paenibacilluscinerisstrain 1-3在同一分枝上,且通过Bootstrap的验证表明它们具有较高的置信度,支持度达到85%(图2a),因此可以将分离菌株B1确定为厚壁类芽孢杆菌(Paenibacilluscineris)。菌株B002与Bacilluscereusstrain AER315-11在同一分枝上,且通过Bootstrap的验证表明它们具有较高的置信度,支持度达到77%(图2b),因此可以将分离菌株B002确定为蜡样芽胞杆菌(Bacilluscereus)。菌株B003与GenBank内的Bacillussp.hb38在同一分支上(图2 c),菌株B004与GenBank内的Bacillussp.CZGRY8在同一分支上(图2 d),对于鉴定到属的菌株B003和B004进一步利用生化鉴定方法确认。

图2 以16S rDNA基因序列为分子标记的4株细菌系统发育树

2.1.3 细菌的生化鉴定结果 对16S rDNA系统发育分析鉴定到属的菌株B003、B004,进一步利用法国梅里埃ATP鉴定系统鉴定。由表1可知,菌株B003生化试验鉴定结果为蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus),鉴定百分率为92%。

表1 菌株B003的生理生化鉴定试验结果Table 1 Physiological and biochemical tests results of strain B003

由表2可知,菌株B 004生化鉴定试验结果为蕈状芽孢杆菌(Bacillusmycoides),鉴定百分率为81.2%。

表2 菌株B 004的生理生化鉴定试验结果Table 2 Physiological and biochemical tests results of strain B004

番茄酱类的酸性罐头食品中发现有芽孢杆菌的存在,说明可能是杀菌不彻底或有漏罐现象发生[5]。吴海文等[11]采用锰营养、甘露醇卵黄多粘菌素、嗜热耐酸杆菌、脂耐热嗜酸杆菌、溴甲酚紫葡萄糖肉汤、平酸菌增菌和液体硫乙醇酸盐7种液体培养基对供试番茄酱在37 ℃和55 ℃下培养,分离鉴定出的主要细菌是枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和矮小芽孢杆菌,均为产酸不产气可导致番茄酱平酸腐败的好氧芽孢菌。杨红红等[3]的研究证明,番茄酱中污染了芽孢类细菌,会造成番茄酱的异味、变色的现象。芽孢杆菌(如解淀粉芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌)是红油豆瓣酱产气胀罐的主要原因[12]。

2.2 真菌的鉴定

2.2.1 真菌的菌落形态及镜检结果 从番茄酱中分离、纯化得到1株真菌,编号为F001。如图3所示,该真菌在麦汁琼脂培养基上(28±1) ℃需氧培养3 d后,菌落呈乳白色,湿润、质地均匀、菌体单细胞呈腊肠形,出芽生殖。

图3 真菌的菌落形态及镜检结果(1000×)

2.2.2 真菌ITS同源性比对与系统发育分析 将菌株F001的扩增基因序列与GenBank内已知菌株的相应序列进行比对,通过同源性比对结果构建系统发育进化树。菌株F001与多株Pichiakudriavzstrain的同源性达99%以上。菌株F001与Pichiakudriavzstrain CBS5147、Pichiakudriavzstrain 573、Pichiakudriavzstrain SJP、PichiakudriavzCDA 169Y2在同一分枝上,通过Bootstrap的验证表明它们具有较高的置信,支持度达到84%(图4)因此可以将分离菌株F001确定为奥默毕赤酵母(Pichiakudriavzevii)。

图4 以ITS序列为分子标记的酵母菌系统发育树

在低pH、低水活性、低湿度、高盐或高糖的食品中,多数细菌无法在这种环境中生长繁殖,而酵母菌由于其耐受性较强,能够生长[13]。毕赤酵母属常在酸性食品中存在生长,为一些不耐酸的腐败菌创造条件,并引起食品腐败变质[14]。姚晓瑞宁等[15]从库尔勒香梨中分离出了奥默毕赤酵母(Pichiakudriavzevii),该菌具有耐高糖、低酸、耐乙醇及二氧化硫等特性。本研究从涨罐番茄酱中分离出了奥默毕赤酵母,这是引起番茄酱涨袋的主要腐败真菌。陆文俊等[16]从蜂蜜、草莓、香蕉、橙子、油桃、芒果中共分离出了22株酵母,研究发现这些酵母菌是引起水果腐败的主要微生物。

闫国宏等[17]对从疑似胀袋的番茄酱中检测出酵母菌和霉菌,分析后认为引起高温条件下(38 ℃以上)的番茄酱胀袋,是由于罐头加热杀菌不充分,或罐头密封不良导致真空度不够或漏气引起的。番茄酱产品特性决定其发生产气变质的概率极低,但当原料受到的污染程度较严重,生产过程中工艺,参数或某个工序运行环节出现异常波动、生产设备管路存在泄漏或死角、产品杀菌不彻底、罐装机杀菌温度不足或受到污染、产品贮存不当或贮存温度过高时、无菌袋质量存在缺陷和被污染及产品处于非商业无菌状态时均存在产气变质的隐患。罐装番茄酱产品应满足商业无菌的要求,销往热带地区的产品,在商业无菌检测同时建议同时55 ℃保温5～7 d后观察其商业无菌状态,以有效避免产品在高温贮存条件下放置一段时间后出现产气或变质问题[18]。

3 结论

本研究对胀罐番茄酱污染微生物进行分离和纯化,获得4株形态不一的细菌。进一步对分离的细菌进行了形态学观察、16S rDNA分子序列测序、构建系统发育树,并结合生理生化鉴定,细菌B001、B002、B003、B004分别为厚壁类芽孢杆菌(Paenibacilluscineris)、蜡样芽胞杆菌(Bacilluscereus)、蜡样芽胞杆菌(Bacilluscereus)和蕈状芽孢杆菌(Bacillusmycoides);鉴定结果显示芽孢杆菌属是番茄酱中的主要腐败微生物。从胀罐番茄酱中分离和纯化得到一株单细胞真菌,对该单细胞真菌进行形态学鉴定,ITS分子序列测序并进一步构建系统发育树,确定该菌为奥默毕赤酵母(Pichiakudriavzevil)。因此,番茄酱在加工储藏过程中应注意防止此类微生物的危害。